Le discrepanze nelle sequenze di primer e sonda degli attuali test diagnostici del virus del vaiolo delle scimmie devono essere corrette per migliorare la precisione del rilevamento

Le discrepanze nelle sequenze di primer e sonda degli attuali test diagnostici del virus del vaiolo delle scimmie devono essere corrette per migliorare la precisione del rilevamento

In un recente studio pubblicato su medRxiv * Preprint Server, i ricercatori hanno analizzato le sequenze di primer e sonde dei test generici di reazione a catena della polimerasi (PCR) raccomandati dai Centri statunitensi per il controllo e la prevenzione delle malattie (CDC) per il virus del vaiolo delle scimmie (MPXV).

Studie: Große Fehlpaarungen in den Sequenzen von Primern und Sonden für Diagnosetests für das Monkeypox-Virus. Bildnachweis: Dotted Yeti/Shutterstock

Questo articolo di notizie era una revisione di un rapporto scientifico preliminare che non era stato sottoposto a revisione paritaria al momento della pubblicazione. Dalla sua pubblicazione iniziale, il rapporto scientifico è stato ora sottoposto a revisione paritaria e accettato per la pubblicazione in una rivista accademica. I collegamenti ai rapporti preliminari e sottoposti a revisione paritaria possono essere trovati nella sezione Fonti alla fine di questo articolo. Visualizza fonti

sfondo

MPXV, una specie del genere Orthopoxvirus, ha un genoma di acido desossiribonucleico (DNA) a doppio filamento. L’Organizzazione Mondiale della Sanità (OMS) ha dichiarato la recrudescenza del virus MPXV un’emergenza sanitaria pubblica il 23 luglio 2022, dopo che sono stati segnalati oltre 66.000 casi in 106 paesi. MPXV è il secondo virus di questo tipo a diffondersi rapidamente in tutto il mondo dopo che la sindrome respiratoria acuta grave coronavirus 2 (SARS-CoV-2) è diventata gradualmente un virus endemico.

Per quanto riguarda SARS-CoV-2, il CDC ha pubblicato un test PCR in tempo reale per il rilevamento di MPXV in campioni di acque reflue utilizzando primer e sonde generici mirati a un ceppo MPXV dell’Africa occidentale e del bacino del Congo. Allo stesso modo, altri test PCR in tempo reale rilevano MPXV in campioni clinici.

Il problema è che i primer e le sonde utilizzati in questi test PCR generici si basano su ceppi MPXV circolati quasi dieci anni fa tra il 2002 e il 2009. Data la rapida evoluzione di tutti i virus a DNA, le regioni prese di mira da questi oligo utilizzati per il rilevamento dell’MPXV devono aver subito mutazioni significative.

A proposito dello studio

Nel presente studio, i ricercatori hanno recuperato 683 genomi completi di MPXV dal database Global Initiative on Avian Influenza Data (GISAID), disponibile fino al 5 agosto 2022, e hanno allineato le loro sequenze di oligocon le sequenze di primer dei test diagnostici MPXV attualmente utilizzati. Inoltre, hanno allineato le sequenze di primer e sonda e i loro complementi inversi nei sette test PCR in tempo reale su 1.779 genomi MPXV e hanno calcolato la percentuale di genomi con una concordanza del 100%. Questi test hanno preso di mira i geni O2L, F3L, C3L e G2R per il rilevamento di MPXV.

Il team ha inoltre valutato tre test PCR in tempo reale per il rilevamento di virus del genere Orthopoxvirus. Infine, i ricercatori hanno sintetizzato i primer corretti per la mancata corrispondenza o un frammento sintetico del gene MPXV per testare gli effetti della mancata corrispondenza e li hanno confrontati con il test generico per il rilevamento dell'MPXV.

Risultati dello studio

Hanno utilizzato 1.730 genomi MPXV completi campionati durante l’epidemia globale del 2022. L'allineamento delle tre sequenze oligologiche e dei loro complementi inversi dai test MPXV generici ha prodotto sequenze forward MPXV generiche (MPXV-F) con identità del 100% su quattro genomi e primer inversi generici (MPXV-R) che corrispondevano all'1,73% dei genomi. Inoltre, i ricercatori hanno riscontrato 31 disallineamenti di sequenza nel 99,08% e nel 97,46% delle sequenze forward generiche di MPXV (MPXV-F) e 32 primer inversi generici (MPXV-R), rispettivamente.

Mentre il primo aveva una singola mutazione sinonimo, A194165G, nel 99,08% dei genomi MPXV pubblicati, il secondo aveva una sostituzione non sinonimo, G194233A, nel 97,46% dei genomi. Al contrario, la sequenza della sonda MPXV (MPV-P) è stata conservata e abbinata al 99,31% dei genomi nel database.

Il risultato principale dello studio è stato che i test MPXV generici attualmente utilizzati potrebbero non rilevare l’MPXV in modo ottimale e accurato. Indipendentemente dalla posizione, qualsiasi mancata corrispondenza all'interno della sequenza dei primer potrebbe ridurre la stabilità termica del duplex di DNA primer-templato e influenzare le prestazioni della PCR. Gli autori hanno notato una discrepanza tra due modelli di primer che ha avuto un impatto combinato sulle prestazioni della PCR. Ha fornito una stima peggiore di circa 11 volte del DNA modello iniziale e un aumento di quattro volte del limite di rilevamento (LOD) del 95%. Pertanto, il test corretto per la mancata corrispondenza con assoluta complementarità tra primer e genomi MPXV attuali potrebbe consentire un rilevamento MPXV più sensibile e accurato.

Inoltre, i risultati dello studio hanno mostrato che le variazioni genetiche nelle regioni primer-probe del genoma MPXV potrebbero indicare un modello temporale e spaziale di insorgenza della malattia del vaiolo delle scimmie. Tre test, MPV_F3L, MPV_G2R_WA, 283 e OPV_F8L, hanno mostrato il punteggio di concordanza più alto, superiore al 99%, con il database globale del genoma MPXV nel 2022. Tuttavia, la scelta del test varia anche a seconda del tipo di campione. Ad esempio, questi tre test hanno funzionato bene per campioni clinici, ma non per campioni di acque reflue, che potrebbero contenere rifiuti umani e feci di gatti, cani, topi, conigli e mucche.

Diploma

Il test con correzione della mancata corrispondenza sviluppato nello studio ha dimostrato oltre il 97% di complementarità con i genomi MPXV. Pertanto, ha mostrato una sensibilità più elevata e un potenziale di quantificazione migliorato e potrebbe aiutare il rilevamento di MPXV.

Il miglioramento delle capacità diagnostiche del MPXV è fondamentale poiché i funzionari della sanità pubblica e i medici combattono l’epidemia di MPXV. Gli studi futuri dovrebbero quindi concentrarsi sullo sviluppo di un test diagnostico MPXV ancora migliore che tenga conto di altri fattori che influenzano l'efficienza diagnostica e gli effetti correlati alla mancata corrispondenza (ad esempio, la qualità del DNA modello, la master mix della PCR e la formazione di primer-dimero).

Questo articolo di notizie era una revisione di un rapporto scientifico preliminare che non era stato sottoposto a revisione paritaria al momento della pubblicazione. Dalla sua pubblicazione iniziale, il rapporto scientifico è stato ora sottoposto a revisione paritaria e accettato per la pubblicazione in una rivista accademica. I collegamenti ai rapporti preliminari e sottoposti a revisione paritaria possono essere trovati nella sezione Fonti alla fine di questo articolo. Visualizza fonti

Riferimenti:

• Vorläufiger wissenschaftlicher Bericht.
  Fuqing Wu, Jeremiah Oghuan, Anna Gitter, Kristina D. Mena, Eric L. Brown. (2022). Große Fehlpaarungen in den Sequenzen von Primern und Sonden für Diagnosetests für das Monkeypox-Virus. medRxiv. doi: https://doi.org/10.1101/2022.08.10.22278644 https://www.medrxiv.org/content/10.1101/2022.08.10.22278644v2
• Von Experten begutachteter und veröffentlichter wissenschaftlicher Bericht.
  Wu, Fuqing, Jeremiah Oghuan, Anna Gitter, Kristina D. Mena und Eric L. Brown. 2022. „Große Fehlpaarungen in den Sequenzen von Primern und Sonden für Monkeypox-Virus-Diagnosetests.“ Journal of Medical Virology 95 (1). https://doi.org/10.1002/jmv.28395. https://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/jmv.28395.

Revisioni degli articoli

• 15. Mai 2023 – Das vorab gedruckte vorläufige Forschungspapier, auf dem dieser Artikel basiert, wurde zur Veröffentlichung in einer von Experten begutachteten wissenschaftlichen Zeitschrift angenommen. Dieser Artikel wurde entsprechend bearbeitet und enthält nun einen Link zum endgültigen, von Experten begutachteten Artikel, der jetzt im Abschnitt „Quellen“ angezeigt wird.