Lai uzlabotu noteikšanas precizitāti, ir jālabo pašreizējo pērtiķu baku vīrusa diagnostikas testu primeru un zondes secību neatbilstības

Lai uzlabotu noteikšanas precizitāti, ir jālabo pašreizējo pērtiķu baku vīrusa diagnostikas testu primeru un zondes secību neatbilstības

Nesenā pētījumā, kas publicēts medRxiv * Preprint Server, Pētnieki analizēja Amerikas Savienoto Valstu Slimību kontroles un profilakses centra (CDC) ieteiktās vispārīgās reālā laika polimerāzes ķēdes reakcijas (PCR) testus pērtiķu baku vīrusa (MPXV) noteikšanai.

Studie: Große Fehlpaarungen in den Sequenzen von Primern und Sonden für Diagnosetests für das Monkeypox-Virus. Bildnachweis: Dotted Yeti/Shutterstock

Šis ziņu raksts bija pārskats par sākotnējo zinātnisko ziņojumu, kas publicēšanas laikā nebija recenzēts. Kopš sākotnējās publicēšanas zinātniskais ziņojums tagad ir recenzēts un pieņemts publicēšanai akadēmiskajā žurnālā. Saites uz provizoriskajiem un salīdzinošajiem pārskatiem ir atrodamas sadaļā Avoti šī raksta beigās. Skatīt avotus

fons

MPXV, Orthopoxvirus ģints sugai, ir divpavedienu dezoksiribonukleīnskābes (DNS) genoms. Pasaules Veselības organizācija (PVO) MPXV atdzimšanu pasludināja par ārkārtas situāciju sabiedrības veselības jomā 2022. gada 23. jūlijā pēc tam, kad tika ziņots par vairāk nekā 66 000 gadījumiem 106 valstīs. MPXV ir otrais šāds vīruss, kas strauji izplatījies visā pasaulē pēc tam, kad smaga akūta respiratorā sindroma koronavīruss 2 (SARS-CoV-2) pakāpeniski kļuva par endēmisku vīrusu.

Attiecībā uz SARS-CoV-2 CDC publicēja reāllaika PCR testu MPXV noteikšanai notekūdeņu paraugos, izmantojot vispārīgus primerus un zondes, kas vērstas uz Rietumāfrikas un Kongo baseina MPXV celmu. Tāpat citi reāllaika PCR testi nosaka MPXV klīniskajos paraugos.

Problēma ir tāda, ka šajos vispārīgajos PCR testos izmantotie praimeri un zondes ir balstīti uz MPXV celmiem, kas cirkulēja gandrīz pirms desmit gadiem laikā no 2002. līdz 2009. gadam. Ņemot vērā visu DNS vīrusu straujo attīstību, reģionos, uz kuriem attiecas šie MPXV noteikšanai izmantotie oligo, noteikti ir notikušas nozīmīgas mutācijas.

Par pētījumu

Šajā pētījumā pētnieki izguva 683 pilnīgus MPXV genomus no globālās putnu gripas datu (GISAID) datu bāzes, kas bija pieejama līdz 2022. gada 5. augustam, un saskaņoja to oligo sekvences ar pašlaik izmantoto MPXV diagnostikas testu primer sekvencēm. Turklāt viņi septiņos reālā laika PCR testos saskaņoja primeru un zondes sekvences un to reversos komplementus ar 1779 MPXV genomiem un aprēķināja genomu procentuālo daļu ar 100% vienošanos. Šie testi bija vērsti uz O2L, F3L, C3L un G2R gēniem MPXV noteikšanai.

Komanda arī novērtēja trīs reāllaika PCR testus, lai noteiktu Orthopoxvirus ģints vīrusus. Visbeidzot, pētnieki sintezēja neatbilstības koriģētos primerus vai sintētisko MPXV gēna fragmentu, lai pārbaudītu neatbilstības efektus, un salīdzināja tos ar vispārējo MPXV noteikšanas testu.

Studiju rezultāti

Viņi izmantoja 1730 pilnīgus MPXV genomus, kas tika ņemti 2022. gada globālā uzliesmojuma laikā. Trīs oligo sekvenču un to reverso komplementu izlīdzināšana no vispārējiem MPXV testiem radīja vispārējas MPXV priekšējās sekvences (MPXV-F) ar 100% identitāti četriem genomiem un vispārīgos reversos primerus (MPXV-R), kas atbilda 1,73% genomu. Turklāt pētnieki atklāja 31 secību neatbilstību attiecīgi 99,08% un 97,46% MPXV vispārīgo priekšējo secību (MPXV-F) un 32 vispārīgo reverso praimeru (MPXV-R).

Kamēr pirmajam bija viena sinonīma mutācija A194165G 99,08% publicēto MPXV genomu, otrajam bija nesinonīma aizstāšana G194233A 97,46% genomu. Gluži pretēji, MPXV zondes secība (MPV-P) tika saglabāta un saskaņota ar 99, 31% datubāzes genomu.

Pētījuma primārais atklājums bija tāds, ka pašlaik izmantotie vispārīgie MPXV testi var nebūt optimāli un precīzi noteikt MPXV. Neatkarīgi no pozīcijas jebkura neatbilstība primera secībā var samazināt primer-template DNS dupleksa termisko stabilitāti un ietekmēt PCR veiktspēju. Autori atzīmēja neatbilstību starp divām primer veidnēm, kurām bija kopīga ietekme uz PCR veiktspēju. Tas sniedza aptuveni 11 reizes sliktāku sākotnējās veidnes DNS novērtējumu un četras reizes palielināja noteikšanas robežu (LOD) par 95%. Tāpēc neatbilstības koriģētais tests ar absolūtu komplementaritāti starp primeriem un pašreizējiem MPXV genomiem varētu nodrošināt jutīgāku un precīzāku MPXV noteikšanu.

Turklāt pētījuma rezultāti parādīja, ka ģenētiskās variācijas MPXV genoma primer-zondes reģionos var liecināt par pērtiķu baku slimības rašanās temporālu un telpisku modeli. Trīs testi, MPV_F3L, MPV_G2R_WA, 283 un OPV_F8L, 2022. gadā uzrādīja augstāko atbilstības punktu skaitu ar globālo MPXV genoma datubāzi — vairāk nekā 99%. Tomēr arī testa izvēle atšķiras atkarībā no parauga veida. Piemēram, šie trīs testi darbojās labi klīniskiem paraugiem, bet ne notekūdeņu paraugiem, kas varētu saturēt cilvēku atkritumus, kā arī kaķu, suņu, peļu, trušu un govju izkārnījumus.

Diploms

Pētījumā izstrādātais neatbilstības koriģētais tests parādīja vairāk nekā 97% komplementaritāti ar MPXV genomiem. Tādējādi tas uzrādīja lielāku jutību un uzlabotu kvantitatīvās noteikšanas potenciālu un varētu palīdzēt MPXV noteikšanā.

Uzlabotas MPXV diagnostikas iespējas ir ļoti svarīgas, jo sabiedrības veselības amatpersonas un ārsti cīnās ar MPXV uzliesmojumu. Tāpēc turpmākajos pētījumos jākoncentrējas uz vēl labāka MPXV diagnostikas testa izstrādi, kurā ņemti vērā citi faktori, kas ietekmē diagnostikas efektivitāti un ar neatbilstību saistītos efektus (piemēram, veidnes DNS kvalitāte, PCR galvenais maisījums un primer-dimēra veidošanās).

Šis ziņu raksts bija pārskats par sākotnējo zinātnisko ziņojumu, kas publicēšanas laikā nebija recenzēts. Kopš sākotnējās publicēšanas zinātniskais ziņojums tagad ir recenzēts un pieņemts publicēšanai akadēmiskajā žurnālā. Saites uz provizoriskajiem un salīdzinošajiem pārskatiem ir atrodamas sadaļā Avoti šī raksta beigās. Skatīt avotus

Atsauces:

• Vorläufiger wissenschaftlicher Bericht.
  Fuqing Wu, Jeremiah Oghuan, Anna Gitter, Kristina D. Mena, Eric L. Brown. (2022). Große Fehlpaarungen in den Sequenzen von Primern und Sonden für Diagnosetests für das Monkeypox-Virus. medRxiv. doi: https://doi.org/10.1101/2022.08.10.22278644 https://www.medrxiv.org/content/10.1101/2022.08.10.22278644v2
• Von Experten begutachteter und veröffentlichter wissenschaftlicher Bericht.
  Wu, Fuqing, Jeremiah Oghuan, Anna Gitter, Kristina D. Mena und Eric L. Brown. 2022. „Große Fehlpaarungen in den Sequenzen von Primern und Sonden für Monkeypox-Virus-Diagnosetests.“ Journal of Medical Virology 95 (1). https://doi.org/10.1002/jmv.28395. https://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/jmv.28395.

Rakstu labojumi

• 15. Mai 2023 – Das vorab gedruckte vorläufige Forschungspapier, auf dem dieser Artikel basiert, wurde zur Veröffentlichung in einer von Experten begutachteten wissenschaftlichen Zeitschrift angenommen. Dieser Artikel wurde entsprechend bearbeitet und enthält nun einen Link zum endgültigen, von Experten begutachteten Artikel, der jetzt im Abschnitt „Quellen“ angezeigt wird.