Mismatches in de primer- en probesequenties van de huidige diagnostische tests voor het apenpokkenvirus moeten worden gecorrigeerd om de detectienauwkeurigheid te verbeteren

Mismatches in de primer- en probesequenties van de huidige diagnostische tests voor het apenpokkenvirus moeten worden gecorrigeerd om de detectienauwkeurigheid te verbeteren

Uit een recente studie gepubliceerd in medRxiv * Preprint Server, onderzoekers analyseerden de primer- en probe-sequenties van de door de Amerikaanse Centers for Disease Control and Prevention (CDC) aanbevolen generieke real-time polymerasekettingreactie (PCR) -tests voor het apenpokkenvirus (MPXV).

Studie: Große Fehlpaarungen in den Sequenzen von Primern und Sonden für Diagnosetests für das Monkeypox-Virus. Bildnachweis: Dotted Yeti/Shutterstock

Dit nieuwsartikel was een recensie van een voorlopig wetenschappelijk rapport dat op het moment van publicatie nog niet door vakgenoten was beoordeeld. Sinds de eerste publicatie is het wetenschappelijk rapport nu peer-reviewed en geaccepteerd voor publicatie in een academisch tijdschrift. Links naar de voorlopige en peer-reviewed rapporten zijn te vinden in de sectie Bronnen aan het einde van dit artikel. Bekijk bronnen

achtergrond

MPXV, een soort van het geslacht Orthopoxvirus, heeft een dubbelstrengs deoxyribonucleïnezuur (DNA) genoom. De Wereldgezondheidsorganisatie (WHO) heeft de heropleving van MPXV op 23 juli 2022 uitgeroepen tot een noodsituatie voor de volksgezondheid, nadat er in 106 landen meer dan 66.000 gevallen waren gemeld. MPXV is het tweede virus dat zich snel wereldwijd verspreidt nadat het ernstige acute respiratoire syndroom coronavirus 2 (SARS-CoV-2) geleidelijk een endemisch virus werd.

Met betrekking tot SARS-CoV-2 publiceerde de CDC een real-time PCR-test voor MPXV-detectie in afvalwatermonsters met behulp van generieke primers en probes gericht op een MPXV-stam uit West-Afrika en het Congobekken. Op dezelfde manier detecteren andere real-time PCR-testen MPXV in klinische monsters.

Het probleem is dat de primers en probes die in deze generieke PCR-testen worden gebruikt, gebaseerd zijn op MPXV-stammen die bijna tien jaar geleden tussen 2002 en 2009 circuleerden. Gezien de snelle evolutie van alle DNA-virussen moeten de regio's waarop deze oligo's zich richten en die worden gebruikt voor MPXV-detectie aanzienlijke mutaties hebben ondergaan.

Over de studie

In de huidige studie hebben onderzoekers 683 volledige MPXV-genomen opgehaald uit de Global Initiative on Avian Influenza Data (GISAID)-database, beschikbaar tot 5 augustus 2022, en hun oligosequenties uitgelijnd met de primersequenties van de momenteel gebruikte diagnostische MPXV-tests. Bovendien hebben ze primer- en probe-sequenties en hun omgekeerde complementen in de zeven real-time PCR-testen op één lijn gebracht met 1.779 MPXV-genomen en het percentage genomen berekend met 100% overeenstemming. Deze testen waren gericht op de O2L-, F3L-, C3L- en G2R-genen voor MPXV-detectie.

Het team evalueerde ook drie real-time PCR-testen voor de detectie van virussen van het geslacht Orthopoxvirus. Ten slotte synthetiseerden de onderzoekers de voor mismatch gecorrigeerde primers of een synthetisch MPXV-genfragment om de mismatch-effecten te testen en vergeleken deze met de generieke test voor MPXV-detectie.

Studieresultaten

Ze gebruikten 1.730 complete MPXV-genomen die tijdens de wereldwijde uitbraak van 2022 waren bemonsterd. Uitlijning van de drie oligosequenties en hun omgekeerde complementen uit de generieke MPXV-testen leverde generieke MPXV-voorwaartse sequenties (MPXV-F) op met 100% identiteit met vier genomen en generieke reverse primers (MPXV-R) die overeenkwamen met 1,73% van de genomen. Bovendien vonden onderzoekers 31 sequentiemismatches in respectievelijk 99,08% en 97,46% van de generieke voorwaartse sequenties van MPXV (MPXV-F) en 32 generieke reverse primers (MPXV-R).

Terwijl de eerste een enkele synonieme mutatie had, A194165G, in 99,08% van de gepubliceerde MPXV-genomen, had de laatste een niet-synonieme substitutie, G194233A, in 97,46% van de genomen. Integendeel, de MPXV-probesequentie (MPV-P) werd geconserveerd en gekoppeld aan 99,31% van de genomen in de database.

De belangrijkste bevinding van het onderzoek was dat de momenteel gebruikte generieke MPXV-tests MPXV mogelijk niet optimaal en nauwkeurig detecteren. Ongeacht de positie zou elke mismatch binnen de primersequentie de thermische stabiliteit van de DNA-duplex van de primer-matrijs kunnen verminderen en de PCR-prestaties kunnen beïnvloeden. De auteurs merkten een mismatch op tussen twee primersjablonen die een gecombineerde impact hadden op de PCR-prestaties. Het leverde een ongeveer elf keer slechtere schatting op van het initiële template-DNA en een viervoudige toename van de detectielimiet (LOD) van 95%. Daarom zou de voor mismatch gecorrigeerde test met absolute complementariteit tussen primers en huidige MPXV-genomen een gevoeliger en nauwkeurigere MPXV-detectie mogelijk kunnen maken.

Bovendien toonden de onderzoeksresultaten aan dat genetische variaties in de primer-probegebieden van het MPXV-genoom zouden kunnen duiden op een temporeel en ruimtelijk patroon van het ontstaan ​​van de apenpokkenziekte. Drie testen, MPV_F3L, MPV_G2R_WA, 283 en OPV_F8L, vertoonden de hoogste concordantiescore van meer dan >99% met de mondiale MPXV-genoomdatabase in 2022. De keuze van de test varieert echter ook afhankelijk van het monstertype. Deze drie tests werkten bijvoorbeeld goed voor klinische monsters, maar niet voor afvalwatermonsters, die zowel menselijk afval als uitwerpselen van katten, honden, muizen, konijnen en koeien konden bevatten.

Diploma

De in het onderzoek ontwikkelde, voor mismatch gecorrigeerde test toonde een complementariteit van meer dan 97% aan met MPXV-genomen. Het vertoonde dus een hogere gevoeligheid en een verbeterd kwantificatiepotentieel en zou de MPXV-detectie kunnen ondersteunen.

Verbeterde diagnostische mogelijkheden voor MPXV zijn van cruciaal belang nu volksgezondheidsfunctionarissen en artsen de MPXV-uitbraak bestrijden. Toekomstige studies zouden zich daarom moeten concentreren op het ontwikkelen van een nog betere diagnostische MPXV-test die rekening houdt met andere factoren die de diagnostische efficiëntie en mismatch-gerelateerde effecten beïnvloeden (bijvoorbeeld de kwaliteit van het template-DNA, de PCR-mastermix en de vorming van primer-dimeer).

Dit nieuwsartikel was een recensie van een voorlopig wetenschappelijk rapport dat op het moment van publicatie nog niet door vakgenoten was beoordeeld. Sinds de eerste publicatie is het wetenschappelijk rapport nu peer-reviewed en geaccepteerd voor publicatie in een academisch tijdschrift. Links naar de voorlopige en peer-reviewed rapporten zijn te vinden in de sectie Bronnen aan het einde van dit artikel. Bekijk bronnen

Referenties:

• Vorläufiger wissenschaftlicher Bericht.
  Fuqing Wu, Jeremiah Oghuan, Anna Gitter, Kristina D. Mena, Eric L. Brown. (2022). Große Fehlpaarungen in den Sequenzen von Primern und Sonden für Diagnosetests für das Monkeypox-Virus. medRxiv. doi: https://doi.org/10.1101/2022.08.10.22278644 https://www.medrxiv.org/content/10.1101/2022.08.10.22278644v2
• Von Experten begutachteter und veröffentlichter wissenschaftlicher Bericht.
  Wu, Fuqing, Jeremiah Oghuan, Anna Gitter, Kristina D. Mena und Eric L. Brown. 2022. „Große Fehlpaarungen in den Sequenzen von Primern und Sonden für Monkeypox-Virus-Diagnosetests.“ Journal of Medical Virology 95 (1). https://doi.org/10.1002/jmv.28395. https://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/jmv.28395.

Artikelrevisies

• 15. Mai 2023 – Das vorab gedruckte vorläufige Forschungspapier, auf dem dieser Artikel basiert, wurde zur Veröffentlichung in einer von Experten begutachteten wissenschaftlichen Zeitschrift angenommen. Dieser Artikel wurde entsprechend bearbeitet und enthält nun einen Link zum endgültigen, von Experten begutachteten Artikel, der jetzt im Abschnitt „Quellen“ angezeigt wird.