Feilpasninger i primer- og probesekvensene til gjeldende diagnostiske tester for apekoppevirus må korrigeres for å forbedre deteksjonsnøyaktigheten

Feilpasninger i primer- og probesekvensene til gjeldende diagnostiske tester for apekoppevirus må korrigeres for å forbedre deteksjonsnøyaktigheten

I en fersk studie publisert i medRxiv * Preprint Server, forskere analyserte primer- og probesekvensene til de amerikanske sentre for sykdomskontroll og forebygging (CDC) anbefalte generiske sanntids polymerasekjedereaksjons (PCR) tester for apekoppevirus (MPXV).

Studie: Große Fehlpaarungen in den Sequenzen von Primern und Sonden für Diagnosetests für das Monkeypox-Virus. Bildnachweis: Dotted Yeti/Shutterstock

Denne nyhetsartikkelen var en gjennomgang av en foreløpig vitenskapelig rapport som ikke hadde blitt fagfellevurdert på publiseringstidspunktet. Siden den første publiseringen har den vitenskapelige rapporten nå blitt fagfellevurdert og akseptert for publisering i et akademisk tidsskrift. Lenker til de foreløpige og fagfellevurderte rapportene finner du i Kilder-delen på slutten av denne artikkelen. Se kilder

bakgrunn

MPXV, en art av slekten Orthopoxvirus, har et dobbelttrådet deoksyribonukleinsyre (DNA) genom. Verdens helseorganisasjon (WHO) erklærte gjenoppblomstringen av MPXV som en folkehelsenød 23. juli 2022, etter at over 66 000 tilfeller ble rapportert i 106 land. MPXV er det andre slike virus som sprer seg raskt over hele verden etter at alvorlig akutt respiratorisk syndrom coronavirus 2 (SARS-CoV-2) gradvis ble et endemisk virus.

Når det gjelder SARS-CoV-2, publiserte CDC en sanntids PCR-test for MPXV-deteksjon i avløpsvannprøver ved bruk av generiske primere og prober rettet mot en vestafrikansk og en MPXV-stamme fra Kongobassenget. På samme måte oppdager andre sanntids PCR-analyser MPXV i kliniske prøver.

Problemet er at primerne og probene som brukes i disse generiske PCR-analysene er basert på MPXV-stammer som sirkulerte for nesten et tiår siden mellom 2002 og 2009. Gitt den raske utviklingen av alle DNA-virus, må regionene som er målrettet av disse oligoene som brukes til MPXV-deteksjon, ha gjennomgått betydelige mutasjoner.

Om studiet

I denne studien hentet forskerne 683 komplette MPXV-genomer fra databasen Global Initiative on Avian Influenza Data (GISAID), tilgjengelig frem til 5. august 2022, og justerte oligosekvensene deres med primersekvensene til for tiden brukte MPXV-diagnostiske tester. I tillegg justerte de primer- og probesekvenser og deres omvendte komplementer i de syv sanntids PCR-analysene til 1779 MPXV-genomer og beregnet prosentandelen av genomer med 100 % samsvar. Disse analysene var rettet mot O2L-, F3L-, C3L- og G2R-genene for MPXV-deteksjon.

Teamet evaluerte også tre sanntids PCR-analyser for påvisning av virus fra Orthopoxvirus-slekten. Til slutt syntetiserte forskerne de mismatch-korrigerte primerne eller et syntetisk MPXV-genfragment for å teste mismatch-effektene og sammenlignet dem med den generiske analysen for MPXV-deteksjon.

Studieresultater

De brukte 1730 komplette MPXV-genomer som ble prøvet under det globale utbruddet i 2022. Justering av de tre oligosekvensene og deres omvendte komplementer fra de generiske MPXV-analysene ga generiske MPXV-foroversekvenser (MPXV-F) med 100 % identitet til fire genomer og generiske omvendte primere (MPXV-R) som matchet 1,73 % av genomene. I tillegg fant forskere 31 sekvensfeil i henholdsvis 99,08 % og 97,46 % av MPXV generiske fremoversekvenser (MPXV-F) og 32 generiske reversprimere (MPXV-R).

Mens førstnevnte hadde en enkelt synonym mutasjon, A194165G, i 99,08% av publiserte MPXV-genomer, hadde sistnevnte en ikke-synonym substitusjon, G194233A, i 97,46% av genomene. Tvert imot ble MPXV-probesekvensen (MPV-P) bevart og matchet til 99,31 % av genomene i databasen.

Det primære funnet av studien var at for tiden brukte generiske MPXV-tester kanskje ikke optimalt og nøyaktig oppdager MPXV. Uavhengig av posisjon kan enhver mismatch i primersekvensen redusere den termiske stabiliteten til primer-mal-DNA-dupleksen og påvirke PCR-ytelsen. Forfatterne bemerket et misforhold mellom to primermaler som hadde en kombinert innvirkning på PCR-ytelse. Det ga et omtrent 11 ganger dårligere estimat av det opprinnelige templat-DNA og en fire ganger økning i deteksjonsgrensen (LOD) på 95 %. Derfor kan den mismatch-korrigerte analysen med absolutt komplementaritet mellom primere og gjeldende MPXV-genomer muliggjøre mer sensitiv og nøyaktig MPXV-deteksjon.

I tillegg viste studieresultatene at genetiske variasjoner i primer-probe-regionene til MPXV-genomet kan indikere et tidsmessig og romlig mønster av fremvekst av apekoppesykdom. Tre analyser, MPV_F3L, MPV_G2R_WA, 283 og OPV_F8L, viste den høyeste samsvarskåren på over >99 % med den globale MPXV-genomdatabasen i 2022. Valget av analyse varierer imidlertid også avhengig av prøvetypen. For eksempel fungerte disse tre testene bra for kliniske prøver, men ikke for spillvannsprøver, som kunne inneholde menneskelig avfall samt avføring fra katter, hunder, mus, kaniner og kyr.

Diplom

Den mismatch-korrigerte analysen utviklet i studien demonstrerte over 97 % komplementaritet til MPXV-genomer. Dermed viste den høyere følsomhet og forbedret kvantifiseringspotensial og kunne hjelpe MPXV-deteksjon.

Forbedrede MPXV-diagnostiske evner er avgjørende når offentlige helsetjenestemenn og leger bekjemper MPXV-utbruddet. Fremtidige studier bør derfor fokusere på å utvikle en enda bedre MPXV diagnostisk analyse som tar hensyn til andre faktorer som påvirker diagnostisk effektivitet og mismatch-relaterte effekter (f.eks. kvaliteten på mal-DNA, PCR-masterblanding og primer-dimer-dannelse).

Denne nyhetsartikkelen var en gjennomgang av en foreløpig vitenskapelig rapport som ikke hadde blitt fagfellevurdert på publiseringstidspunktet. Siden den første publiseringen har den vitenskapelige rapporten nå blitt fagfellevurdert og akseptert for publisering i et akademisk tidsskrift. Lenker til de foreløpige og fagfellevurderte rapportene finner du i Kilder-delen på slutten av denne artikkelen. Se kilder

Referanser:

• Vorläufiger wissenschaftlicher Bericht.
  Fuqing Wu, Jeremiah Oghuan, Anna Gitter, Kristina D. Mena, Eric L. Brown. (2022). Große Fehlpaarungen in den Sequenzen von Primern und Sonden für Diagnosetests für das Monkeypox-Virus. medRxiv. doi: https://doi.org/10.1101/2022.08.10.22278644 https://www.medrxiv.org/content/10.1101/2022.08.10.22278644v2
• Von Experten begutachteter und veröffentlichter wissenschaftlicher Bericht.
  Wu, Fuqing, Jeremiah Oghuan, Anna Gitter, Kristina D. Mena und Eric L. Brown. 2022. „Große Fehlpaarungen in den Sequenzen von Primern und Sonden für Monkeypox-Virus-Diagnosetests.“ Journal of Medical Virology 95 (1). https://doi.org/10.1002/jmv.28395. https://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/jmv.28395.

Artikkelrevisjoner

• 15. Mai 2023 – Das vorab gedruckte vorläufige Forschungspapier, auf dem dieser Artikel basiert, wurde zur Veröffentlichung in einer von Experten begutachteten wissenschaftlichen Zeitschrift angenommen. Dieser Artikel wurde entsprechend bearbeitet und enthält nun einen Link zum endgültigen, von Experten begutachteten Artikel, der jetzt im Abschnitt „Quellen“ angezeigt wird.