As incompatibilidades nas sequências de primers e sondas dos atuais testes de diagnóstico do vírus da varíola dos macacos precisam ser corrigidas para melhorar a precisão da detecção

As incompatibilidades nas sequências de primers e sondas dos atuais testes de diagnóstico do vírus da varíola dos macacos precisam ser corrigidas para melhorar a precisão da detecção

Num estudo recente publicado em medRxiv * Preprint Server, os pesquisadores analisaram as sequências de primer e sonda dos Centros de Controle e Prevenção de Doenças (CDC) dos Estados Unidos, que recomendaram testes genéricos de reação em cadeia da polimerase (PCR) em tempo real para o vírus da varíola dos macacos (MPXV).

Studie: Große Fehlpaarungen in den Sequenzen von Primern und Sonden für Diagnosetests für das Monkeypox-Virus. Bildnachweis: Dotted Yeti/Shutterstock

Esta notícia foi uma revisão de um relatório científico preliminar que não havia sido revisado por pares no momento da publicação. Desde a sua publicação inicial, o relatório científico foi agora revisto por pares e aceite para publicação numa revista académica. Links para os relatórios preliminares e revisados ​​por pares podem ser encontrados na seção Fontes no final deste artigo. Ver fontes

fundo

MPXV, uma espécie do gênero Orthopoxvirus, possui um genoma de ácido desoxirribonucléico (DNA) de fita dupla. A Organização Mundial da Saúde (OMS) declarou o ressurgimento do MPXV uma emergência de saúde pública em 23 de julho de 2022, depois de mais de 66.000 casos terem sido notificados em 106 países. O MPXV é o segundo vírus desse tipo a se espalhar rapidamente em todo o mundo depois que o coronavírus 2 da síndrome respiratória aguda grave (SARS-CoV-2) gradualmente se tornou um vírus endêmico.

Em relação ao SARS-CoV-2, o CDC publicou um teste PCR em tempo real para detecção de MPXV em amostras de águas residuais usando primers e sondas genéricos direcionados a uma cepa de MPXV da África Ocidental e da Bacia do Congo. Da mesma forma, outros ensaios de PCR em tempo real detectam MPXV em amostras clínicas.

O problema é que os iniciadores e sondas utilizados nestes ensaios genéricos de PCR são baseados em estirpes de MPXV que circularam há quase uma década entre 2002 e 2009. Dada a rápida evolução de todos os vírus de ADN, as regiões visadas por estes oligos utilizados para a detecção de MPXV devem ter sofrido mutações significativas.

Sobre o estudo

No presente estudo, os pesquisadores recuperaram 683 genomas completos de MPXV do banco de dados da Iniciativa Global sobre Dados da Gripe Aviária (GISAID), disponível até 5 de agosto de 2022, e alinharam suas sequências oligo com as sequências de primers dos testes de diagnóstico de MPXV atualmente usados. Além disso, eles alinharam sequências de primers e sondas e seus complementos reversos nos sete ensaios de PCR em tempo real para 1.779 genomas de MPXV e calcularam a porcentagem de genomas com 100% de concordância. Esses ensaios tiveram como alvo os genes O2L, F3L, C3L e G2R para detecção de MPXV.

A equipe também avaliou três ensaios de PCR em tempo real para detecção de vírus do gênero Orthopoxvirus. Finalmente, os pesquisadores sintetizaram os primers corrigidos para incompatibilidades ou um fragmento sintético do gene MPXV para testar os efeitos de incompatibilidade e os compararam com o ensaio genérico para detecção de MPXV.

Resultados do estudo

Eles usaram 1.730 genomas completos de MPXV amostrados durante o surto global de 2022. O alinhamento das três sequências oligo e seus complementos reversos dos ensaios MPXV genéricos produziram sequências diretas genéricas de MPXV (MPXV-F) com 100% de identidade com quatro genomas e iniciadores reversos genéricos (MPXV-R) que correspondiam a 1,73% dos genomas. Além disso, os pesquisadores encontraram 31 incompatibilidades de sequência em 99,08% e 97,46% das sequências diretas genéricas de MPXV (MPXV-F) e 32 primers reversos genéricos (MPXV-R), respectivamente.

Enquanto o primeiro tinha uma única mutação sinônima, A194165G, em 99,08% dos genomas MPXV publicados, o último tinha uma substituição não-sinônima, G194233A, em 97,46% dos genomas. Pelo contrário, a sequência da sonda MPXV (MPV-P) foi conservada e combinada com 99,31% dos genomas na base de dados.

A principal conclusão do estudo foi que os testes genéricos de MPXV usados ​​atualmente podem não detectar o MPXV de maneira ideal e precisa. Independentemente da posição, qualquer incompatibilidade dentro da sequência do iniciador poderia reduzir a estabilidade térmica do duplex de ADN do iniciador-modelo e afectar o desempenho da PCR. Os autores notaram uma incompatibilidade entre dois modelos de primers que tiveram um impacto combinado no desempenho da PCR. Deu uma estimativa aproximadamente 11 vezes pior do DNA modelo inicial e um aumento de quatro vezes no limite de detecção (LOD) de 95%. Portanto, o ensaio corrigido por incompatibilidade com complementaridade absoluta entre primers e genomas atuais de MPXV poderia permitir uma detecção de MPXV mais sensível e precisa.

Além disso, os resultados do estudo mostraram que variações genéticas nas regiões da sonda iniciadora do genoma do MPXV poderiam indicar um padrão temporal e espacial de emergência da doença da varíola dos macacos. Três ensaios, MPV_F3L, MPV_G2R_WA, 283 e OPV_F8L, mostraram a pontuação de concordância mais alta de mais de 99% com o banco de dados global do genoma do MPXV em 2022. No entanto, a escolha do ensaio também varia dependendo do tipo de amostra. Por exemplo, estes três testes funcionaram bem para amostras clínicas, mas não para amostras de águas residuais, que poderiam conter resíduos humanos, bem como fezes de gatos, cães, ratos, coelhos e vacas.

Diploma

O ensaio corrigido para incompatibilidades desenvolvido no estudo demonstrou mais de 97% de complementaridade com os genomas do MPXV. Assim, apresentou maior sensibilidade e melhor potencial de quantificação, podendo auxiliar na detecção de MPXV.

As capacidades aprimoradas de diagnóstico do MPXV são essenciais à medida que as autoridades de saúde pública e os médicos combatem o surto de MPXV. Estudos futuros devem, portanto, concentrar-se no desenvolvimento de um ensaio de diagnóstico de MPXV ainda melhor que leve em consideração outros fatores que influenciam a eficiência do diagnóstico e os efeitos relacionados à incompatibilidade (por exemplo, a qualidade do DNA modelo, mistura mestre de PCR e formação de dímero de primer).

Esta notícia foi uma revisão de um relatório científico preliminar que não havia sido revisado por pares no momento da publicação. Desde a sua publicação inicial, o relatório científico foi agora revisto por pares e aceite para publicação numa revista académica. Links para os relatórios preliminares e revisados ​​por pares podem ser encontrados na seção Fontes no final deste artigo. Ver fontes

Referências:

• Vorläufiger wissenschaftlicher Bericht.
  Fuqing Wu, Jeremiah Oghuan, Anna Gitter, Kristina D. Mena, Eric L. Brown. (2022). Große Fehlpaarungen in den Sequenzen von Primern und Sonden für Diagnosetests für das Monkeypox-Virus. medRxiv. doi: https://doi.org/10.1101/2022.08.10.22278644 https://www.medrxiv.org/content/10.1101/2022.08.10.22278644v2
• Von Experten begutachteter und veröffentlichter wissenschaftlicher Bericht.
  Wu, Fuqing, Jeremiah Oghuan, Anna Gitter, Kristina D. Mena und Eric L. Brown. 2022. „Große Fehlpaarungen in den Sequenzen von Primern und Sonden für Monkeypox-Virus-Diagnosetests.“ Journal of Medical Virology 95 (1). https://doi.org/10.1002/jmv.28395. https://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/jmv.28395.

Revisões de artigos

• 15. Mai 2023 – Das vorab gedruckte vorläufige Forschungspapier, auf dem dieser Artikel basiert, wurde zur Veröffentlichung in einer von Experten begutachteten wissenschaftlichen Zeitschrift angenommen. Dieser Artikel wurde entsprechend bearbeitet und enthält nun einen Link zum endgültigen, von Experten begutachteten Artikel, der jetzt im Abschnitt „Quellen“ angezeigt wird.