Nesúlad v sekvenciách primeru a sondy súčasných diagnostických testov vírusu opičích kiahní je potrebné opraviť, aby sa zlepšila presnosť detekcie

Nesúlad v sekvenciách primeru a sondy súčasných diagnostických testov vírusu opičích kiahní je potrebné opraviť, aby sa zlepšila presnosť detekcie

V nedávnej štúdii publikovanej v medRxiv *Preprint Server, výskumníci analyzovali sekvencie primérov a sond Centra pre kontrolu a prevenciu chorôb Spojených štátov amerických (CDC) odporúčané generické testy polymerázovej reťazovej reakcie (PCR) v reálnom čase pre vírus opičích kiahní (MPXV).

Studie: Große Fehlpaarungen in den Sequenzen von Primern und Sonden für Diagnosetests für das Monkeypox-Virus. Bildnachweis: Dotted Yeti/Shutterstock

Tento spravodajský článok bol recenziou predbežnej vedeckej správy, ktorá nebola v čase uverejnenia recenzovaná. Od svojho počiatočného zverejnenia bola vedecká správa teraz recenzovaná a prijatá na publikovanie v akademickom časopise. Odkazy na predbežné a recenzované správy nájdete v časti Zdroje na konci tohto článku. Zobraziť zdroje

pozadia

MPXV, druh rodu Orthopoxvirus, má dvojvláknový genóm deoxyribonukleovej kyseliny (DNA). Svetová zdravotnícka organizácia (WHO) 23. júla 2022 vyhlásila obnovenie MPXV za núdzový stav pre verejné zdravie po tom, čo bolo hlásených viac ako 66 000 prípadov v 106 krajinách. MPXV je druhým takýmto vírusom, ktorý sa rýchlo šíri po celom svete po tom, čo sa koronavírus 2 závažného akútneho respiračného syndrómu (SARS-CoV-2) postupne stal endemickým vírusom.

Pokiaľ ide o SARS-CoV-2, CDC zverejnilo test PCR v reálnom čase na detekciu MPXV vo vzorkách odpadových vôd s použitím generických primerov a sond zameraných na kmeň MPXV zo západnej Afriky a Konga. Podobne aj iné testy PCR v reálnom čase detegujú MPXV v klinických vzorkách.

Problém je v tom, že priméry a sondy používané v týchto generických PCR testoch sú založené na kmeňoch MPXV, ktoré cirkulovali takmer pred desiatimi rokmi medzi rokmi 2002 a 2009. Vzhľadom na rýchly vývoj všetkých DNA vírusov museli oblasti, na ktoré sa zameriavajú tieto oligo používané na detekciu MPXV, prejsť významnými mutáciami.

O štúdiu

V tejto štúdii výskumníci získali 683 kompletných genómov MPXV z databázy Global Initiative on Avian Influenza Data (GISAID), dostupnej do 5. augusta 2022, a porovnali svoje oligo sekvencie so sekvenciami primérov v súčasnosti používaných diagnostických testov MPXV. Okrem toho porovnali sekvencie primérov a sond a ich reverzné komplementy v siedmich testoch PCR v reálnom čase s 1 779 genómami MPXV a vypočítali percento genómov so 100% zhodou. Tieto testy sa zamerali na gény O2L, F3L, C3L a G2R na detekciu MPXV.

Tím tiež vyhodnotil tri testy PCR v reálnom čase na detekciu vírusov z rodu Orthopoxvirus. Nakoniec výskumníci syntetizovali priméry s korekciou nesúladu alebo syntetický fragment génu MPXV, aby otestovali účinky nesúladu a porovnali ich s generickým testom na detekciu MPXV.

Výsledky štúdie

Použili 1 730 kompletných genómov MPXV odobratých počas globálnej epidémie v roku 2022. Porovnanie troch oligo sekvencií a ich reverzných komplementov z generických MPXV testov poskytlo generické MPXV dopredné sekvencie (MPXV-F) so 100 % identitou so štyrmi genómami a generickými reverznými primérmi (MPXV-R), ktoré sa zhodovali s 1,73 % genómov. Okrem toho výskumníci našli 31 sekvenčných nezhôd v 99,08 % a 97,46 % MPXV generických dopredných sekvencií (MPXV-F) a 32 generických reverzných primérov (MPXV-R).

Zatiaľ čo prvý mal jedinú synonymnú mutáciu, A194165G, v 99,08 % publikovaných genómov MPXV, druhý mal nesynonymnú substitúciu, G194233A, v 97,46 % genómov. Naopak, sekvencia sondy MPXV (MPV-P) bola konzervovaná a zhodná s 99,31 % genómov v databáze.

Primárnym zistením štúdie bolo, že v súčasnosti používané generické testy MPXV nemusia optimálne a presne odhaliť MPXV. Bez ohľadu na polohu môže akýkoľvek nesúlad v sekvencii priméru znížiť tepelnú stabilitu duplexu DNA primér-templát a ovplyvniť výkon PCR. Autori zaznamenali nesúlad medzi dvoma templátmi primérov, ktoré mali kombinovaný vplyv na výkonnosť PCR. Poskytla približne 11-krát horší odhad počiatočnej templátovej DNA a štvornásobné zvýšenie limitu detekcie (LOD) o 95 %. Preto by test s korekciou nesúladu s absolútnou komplementaritou medzi primérmi a súčasnými genómami MPXV mohol umožniť citlivejšiu a presnejšiu detekciu MPXV.

Okrem toho výsledky štúdie ukázali, že genetické variácie v oblastiach primér-sonda genómu MPXV by mohli naznačovať časový a priestorový vzorec výskytu ochorenia opičích kiahní. Tri analýzy, MPV_F3L, MPV_G2R_WA, 283 a OPV_F8L, ukázali najvyššie skóre zhody viac ako 99 % s globálnou databázou genómu MPXV v roku 2022. Výber analýzy sa však tiež líši v závislosti od typu vzorky. Napríklad tieto tri testy fungovali dobre pre klinické vzorky, ale nie pre vzorky odpadových vôd, ktoré by mohli obsahovať ľudský odpad, ako aj výkaly mačiek, psov, myší, králikov a kráv.

Diplom

Test s korekciou nesúladu vyvinutý v štúdii preukázal viac ako 97% komplementaritu s genómami MPXV. Vykázal teda vyššiu citlivosť a zlepšený kvantifikačný potenciál a mohol pomôcť pri detekcii MPXV.

Vylepšené diagnostické možnosti MPXV sú rozhodujúce, pretože úradníci verejného zdravotníctva a lekári bojujú proti vypuknutiu MPXV. Budúce štúdie by sa preto mali zamerať na vývoj ešte lepšieho diagnostického testu MPXV, ktorý berie do úvahy ďalšie faktory, ktoré ovplyvňujú diagnostickú účinnosť a účinky súvisiace s nesúladom (napr. kvalita templátovej DNA, PCR master mix a tvorba primer-diméru).

Tento spravodajský článok bol recenziou predbežnej vedeckej správy, ktorá nebola v čase uverejnenia recenzovaná. Od svojho počiatočného zverejnenia bola vedecká správa teraz recenzovaná a prijatá na publikovanie v akademickom časopise. Odkazy na predbežné a recenzované správy nájdete v časti Zdroje na konci tohto článku. Zobraziť zdroje

Referencie:

• Vorläufiger wissenschaftlicher Bericht.
  Fuqing Wu, Jeremiah Oghuan, Anna Gitter, Kristina D. Mena, Eric L. Brown. (2022). Große Fehlpaarungen in den Sequenzen von Primern und Sonden für Diagnosetests für das Monkeypox-Virus. medRxiv. doi: https://doi.org/10.1101/2022.08.10.22278644 https://www.medrxiv.org/content/10.1101/2022.08.10.22278644v2
• Von Experten begutachteter und veröffentlichter wissenschaftlicher Bericht.
  Wu, Fuqing, Jeremiah Oghuan, Anna Gitter, Kristina D. Mena und Eric L. Brown. 2022. „Große Fehlpaarungen in den Sequenzen von Primern und Sonden für Monkeypox-Virus-Diagnosetests.“ Journal of Medical Virology 95 (1). https://doi.org/10.1002/jmv.28395. https://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/jmv.28395.

Revízie článku

• 15. Mai 2023 – Das vorab gedruckte vorläufige Forschungspapier, auf dem dieser Artikel basiert, wurde zur Veröffentlichung in einer von Experten begutachteten wissenschaftlichen Zeitschrift angenommen. Dieser Artikel wurde entsprechend bearbeitet und enthält nun einen Link zum endgültigen, von Experten begutachteten Artikel, der jetzt im Abschnitt „Quellen“ angezeigt wird.