Felmatchningar i primer- och sondsekvenserna för aktuella diagnostiska tester för appoxvirus måste korrigeras för att förbättra detektionsnoggrannheten

Felmatchningar i primer- och sondsekvenserna för aktuella diagnostiska tester för appoxvirus måste korrigeras för att förbättra detektionsnoggrannheten

I en nyligen publicerad studie publicerad i medRxiv * Preprint Server, Forskare analyserade primer- och sondsekvenserna från de amerikanska Centers for Disease Control and Prevention (CDC) rekommenderade generiska realtidspolymeraskedjereaktions (PCR)-tester för appoxvirus (MPXV).

Studie: Große Fehlpaarungen in den Sequenzen von Primern und Sonden für Diagnosetests für das Monkeypox-Virus. Bildnachweis: Dotted Yeti/Shutterstock

Den här nyhetsartikeln var en recension av en preliminär vetenskaplig rapport som inte hade granskats av experter vid tidpunkten för publiceringen. Sedan den första publiceringen har den vetenskapliga rapporten nu granskats och godkänts för publicering i en akademisk tidskrift. Länkar till de preliminära och expertgranskade rapporterna finns i avsnittet Källor i slutet av den här artikeln. Visa källor

bakgrund

MPXV, en art av släktet Orthopoxvirus, har ett dubbelsträngat deoxiribonukleinsyragenom (DNA). Världshälsoorganisationen (WHO) förklarade återuppkomsten av MPXV som en nödsituation för folkhälsan den 23 juli 2022, efter att över 66 000 fall rapporterats i 106 länder. MPXV är det andra sådana viruset som sprids snabbt över hela världen efter att allvarligt akut respiratoriskt syndrom coronavirus 2 (SARS-CoV-2) gradvis blev ett endemiskt virus.

När det gäller SARS-CoV-2 publicerade CDC ett realtids-PCR-test för MPXV-detektering i avloppsvattenprover med hjälp av generiska primers och sönder riktade mot en västafrikansk och en MPXV-stam från Kongobäckenet. På samma sätt detekterar andra realtids-PCR-analyser MPXV i kliniska prover.

Problemet är att primrarna och sonderna som används i dessa generiska PCR-analyser är baserade på MPXV-stammar som cirkulerade för nästan ett decennium sedan mellan 2002 och 2009. Med tanke på den snabba utvecklingen av alla DNA-virus måste de regioner som riktas mot dessa oligon som används för MPXV-detektion ha genomgått betydande mutationer.

Om studien

I den aktuella studien hämtade forskarna 683 kompletta MPXV-genom från databasen Global Initiative on Avian Influenza Data (GISAID), tillgänglig fram till den 5 augusti 2022, och anpassade deras oligosekvenser med primersekvenserna för för närvarande använda MPXV-diagnostiska tester. Dessutom anpassade de primer- och probsekvenser och deras omvända komplement i de sju realtids-PCR-analyserna till 1 779 MPXV-genom och beräknade procentandelen genom med 100 % överensstämmelse. Dessa analyser riktade in sig på generna O2L, F3L, C3L och G2R för MPXV-detektion.

Teamet utvärderade också tre realtids-PCR-analyser för detektering av virus från Orthopoxvirus-släktet. Slutligen syntetiserade forskarna de felmatchningskorrigerade primrarna eller ett syntetiskt MPXV-genfragment för att testa felmatchningseffekterna och jämförde dem med den generiska analysen för MPXV-detektion.

Studieresultat

De använde 1 730 kompletta MPXV-genom som provades under det globala utbrottet 2022. Justering av de tre oligosekvenserna och deras omvända komplement från de generiska MPXV-analyserna gav generiska MPXV-framåtsekvenser (MPXV-F) med 100 % identitet till fyra genom och generiska omvända primrar (MPXV-R) som matchade 1,73 % av genomen. Dessutom fann forskare 31 sekvensfelmatchningar i 99,08 % och 97,46 % av MPXV generiska framåtsekvenser (MPXV-F) respektive 32 generiska omvända primrar (MPXV-R).

Medan den förra hade en enda synonym mutation, A194165G, i 99,08 % av publicerade MPXV-genom, hade den senare en icke-synonym substitution, G194233A, i 97,46 % av genomen. Tvärtom, MPXV-probsekvensen (MPV-P) konserverades och matchades till 99,31% av genomen i databasen.

Det primära resultatet av studien var att för närvarande använda generiska MPXV-tester kanske inte optimalt och exakt upptäcker MPXV. Oavsett position kan eventuell felparning inom primersekvensen minska den termiska stabiliteten hos primer-mall-DNA-duplexet och påverka PCR-prestanda. Författarna noterade en obalans mellan två primermallar som hade en kombinerad inverkan på PCR-prestanda. Det gav en ungefär elva gånger sämre uppskattning av det initiala mall-DNA och en fyrfaldig ökning av detektionsgränsen (LOD) på 95 %. Därför kan den missmatchningskorrigerade analysen med absolut komplementaritet mellan primrar och nuvarande MPXV-genom möjliggöra mer känslig och exakt MPXV-detektion.

Dessutom visade studieresultaten att genetiska variationer i primer-probregionerna i MPXV-genomet kan indikera ett tidsmässigt och rumsligt mönster av uppkomsten av appoxsjukdom. Tre analyser, MPV_F3L, MPV_G2R_WA, 283 och OPV_F8L, visade den högsta överensstämmelsepoängen på över >99 % med den globala MPXV-genomdatabasen 2022. Valet av analys varierar dock också beroende på provtyp. Till exempel fungerade dessa tre tester bra för kliniska prover, men inte för avloppsvattenprover, som kan innehålla såväl mänskligt avfall som avföring från katter, hundar, möss, kaniner och kor.

Diplom

Den missmatchningskorrigerade analysen som utvecklades i studien visade över 97 % komplementaritet till MPXV-genom. Således visade den högre känslighet och förbättrad kvantifieringspotential och kunde hjälpa MPXV-detektering.

Förbättrade MPXV-diagnostiska funktioner är avgörande när folkhälsotjänstemän och läkare bekämpar MPXV-utbrottet. Framtida studier bör därför fokusera på att utveckla en ännu bättre MPXV diagnostisk analys som tar hänsyn till andra faktorer som påverkar diagnostisk effektivitet och felmatchningsrelaterade effekter (t.ex. kvaliteten på mall-DNA, PCR-mastermix och primer-dimer-bildning).

Den här nyhetsartikeln var en recension av en preliminär vetenskaplig rapport som inte hade granskats av experter vid tidpunkten för publiceringen. Sedan den första publiceringen har den vetenskapliga rapporten nu granskats och godkänts för publicering i en akademisk tidskrift. Länkar till de preliminära och expertgranskade rapporterna finns i avsnittet Källor i slutet av den här artikeln. Visa källor

Referenser:

• Vorläufiger wissenschaftlicher Bericht.
  Fuqing Wu, Jeremiah Oghuan, Anna Gitter, Kristina D. Mena, Eric L. Brown. (2022). Große Fehlpaarungen in den Sequenzen von Primern und Sonden für Diagnosetests für das Monkeypox-Virus. medRxiv. doi: https://doi.org/10.1101/2022.08.10.22278644 https://www.medrxiv.org/content/10.1101/2022.08.10.22278644v2
• Von Experten begutachteter und veröffentlichter wissenschaftlicher Bericht.
  Wu, Fuqing, Jeremiah Oghuan, Anna Gitter, Kristina D. Mena und Eric L. Brown. 2022. „Große Fehlpaarungen in den Sequenzen von Primern und Sonden für Monkeypox-Virus-Diagnosetests.“ Journal of Medical Virology 95 (1). https://doi.org/10.1002/jmv.28395. https://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/jmv.28395.

Artikelrevisioner

• 15. Mai 2023 – Das vorab gedruckte vorläufige Forschungspapier, auf dem dieser Artikel basiert, wurde zur Veröffentlichung in einer von Experten begutachteten wissenschaftlichen Zeitschrift angenommen. Dieser Artikel wurde entsprechend bearbeitet und enthält nun einen Link zum endgültigen, von Experten begutachteten Artikel, der jetzt im Abschnitt „Quellen“ angezeigt wird.