目前猴痘病毒诊断检测引物和探针序列的不匹配需要进行纠正，以提高检测准确性

目前猴痘病毒诊断检测引物和探针序列的不匹配需要进行纠正，以提高检测准确性

在最近发表的一项研究中 医学Rxiv * 预印本服务器，研究人员分析了美国疾病控制和预防中心 (CDC) 推荐的猴痘病毒 (MPXV) 通用实时聚合酶链反应 (PCR) 检测的引物和探针序列。

Studie: Große Fehlpaarungen in den Sequenzen von Primern und Sonden für Diagnosetests für das Monkeypox-Virus. Bildnachweis: Dotted Yeti/Shutterstock

这篇新闻文章是对初步科学报告的评论，该报告在发表时尚未经过同行评审。 自首次发表以来，该科学报告现已经过同行评审并接受在学术期刊上发表。 初步报告和同行评审报告的链接可以在本文末尾的“来源”部分找到。 查看来源

背景

MPXV 属于正痘病毒属，具有双链脱氧核糖核酸 (DNA) 基因组。 106 个国家报告了超过 66,000 例病例后，世界卫生组织 (WHO) 于 2022 年 7 月 23 日宣布 MPXV 重新流行为公共卫生紧急事件。 MPXV 是继严重急性呼吸综合征冠状病毒 2（SARS-CoV-2）逐渐成为地方性病毒之后第二种在全球范围内迅速传播的此类病毒。

关于 SARS-CoV-2，CDC 发布了一项实时 PCR 测试，使用针对西非和刚果盆地 MPXV 毒株的通用引物和探针，对废水样本中的 MPXV 进行检测。 同样，其他实时 PCR 检测可检测临床样本中的 MPXV。

问题在于，这些通用 PCR 检测中使用的引物和探针基于大约十年前 2002 年至 2009 年之间传播的 MPXV 毒株。考虑到所有 DNA 病毒的快速进化，用于 MPXV 检测的这些寡核苷酸的靶向区域必定发生了显着突变。

关于该研究

在本研究中，研究人员从截至 2022 年 8 月 5 日的全球禽流感数据倡议 (GISAID) 数据库中检索了 683 个完整的 MPXV 基因组，并将其寡核苷酸序列与当前使用的 MPXV 诊断测试的引物序列进行比对。 此外，他们在七次实时 PCR 检测中将引物和探针序列及其反向互补序列与 1,779 个 MPXV 基因组进行比对，并计算出 100% 一致的基因组百分比。 这些检测针对 O2L、F3L、C3L 和 G2R 基因进行 MPXV 检测。

该团队还评估了三种用于检测正痘病毒属病毒的实时 PCR 检测。 最后，研究人员合成了错配校正引物或合成的 MPXV 基因片段来测试错配效应，并将其与 MPXV 检测的通用检测进行比较。

研究结果

他们使用了 2022 年全球爆发期间采集的 1,730 个完整 MPXV 基因组样本。 将三个寡核苷酸序列及其来自通用 MPXV 检测的反向互补序列进行比对，产生与四个基因组 100% 同一性的通用 MPXV 正向序列 (MPXV-F)，以及与 1.73% 基因组匹配的通用反向引物 (MPXV-R)。 此外，研究人员还分别在99.08%和97.46%的MPXV通用正向序列（MPXV-F）和32个通用反向引物（MPXV-R）中发现了31个序列错配。

前者在 99.08% 的已发表 MPXV 基因组中存在单一同义突变 A194165G，而后者在 97.46% 的基因组中存在非同义突变 G194233A。 相反，MPXV探针序列（MPV-P）是保守的，并且与数据库中99.31%的基因组匹配。

该研究的主要发现是，目前使用的通用 MPXV 测试可能无法最佳且准确地检测 MPXV。 无论位置如何，引物序列内的任何错配都可能降低引物-模板 DNA 双链体的热稳定性并影响 PCR 性能。 作者注意到两个引物模板之间的不匹配对 PCR 性能产生综合影响。 它对初始模板 DNA 的估计值差了大约 11 倍，检测限 (LOD) 提高了四倍，达到 95%。 因此，引物和当前 MPXV 基因组之间具有绝对互补性的错配校正测定可以实现更灵敏和准确的 MPXV 检测。

此外，研究结果表明，MPXV基因组引物探针区域的遗传变异可以表明猴痘疾病出现的时间和空间模式。 三种检测（MPV_F3L、MPV_G2R_WA、283 和 OPV_F8L）在 2022 年显示与全球 MPXV 基因组数据库的最高一致性分数超过 99%。然而，检测的选择也因样本类型而异。 例如，这三项测试对于临床样本效果很好，但对于废水样本却不起作用，废水样本可能含有人类排泄物以及猫、狗、小鼠、兔子和牛的粪便。

文凭

研究中开发的错配校正测定法证明与 MPXV 基因组的互补性超过 97%。 因此，它表现出更高的灵敏度和改进的定量潜力，可以帮助 MPXV 检测。

在公共卫生官员和医生抗击 MPXV 爆发时，提高 MPXV 诊断能力至关重要。 因此，未来的研究应集中于开发一种更好的 MPXV 诊断检测方法，该检测方法应考虑影响诊断效率和错配相关效应的其他因素（例如模板 DNA 的质量、PCR 主混合物和引物二聚体形成）。

这篇新闻文章是对初步科学报告的评论，该报告在发表时尚未经过同行评审。 自首次发表以来，该科学报告现已经过同行评审并接受在学术期刊上发表。 初步报告和同行评审报告的链接可以在本文末尾的“来源”部分找到。 查看来源

参考：

• Vorläufiger wissenschaftlicher Bericht.
  Fuqing Wu, Jeremiah Oghuan, Anna Gitter, Kristina D. Mena, Eric L. Brown. (2022). Große Fehlpaarungen in den Sequenzen von Primern und Sonden für Diagnosetests für das Monkeypox-Virus. medRxiv. doi: https://doi.org/10.1101/2022.08.10.22278644 https://www.medrxiv.org/content/10.1101/2022.08.10.22278644v2
• Von Experten begutachteter und veröffentlichter wissenschaftlicher Bericht.
  Wu, Fuqing, Jeremiah Oghuan, Anna Gitter, Kristina D. Mena und Eric L. Brown. 2022. „Große Fehlpaarungen in den Sequenzen von Primern und Sonden für Monkeypox-Virus-Diagnosetests.“ Journal of Medical Virology 95 (1). https://doi.org/10.1002/jmv.28395. https://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/jmv.28395.

文章修改

• 15. Mai 2023 – Das vorab gedruckte vorläufige Forschungspapier, auf dem dieser Artikel basiert, wurde zur Veröffentlichung in einer von Experten begutachteten wissenschaftlichen Zeitschrift angenommen. Dieser Artikel wurde entsprechend bearbeitet und enthält nun einen Link zum endgültigen, von Experten begutachteten Artikel, der jetzt im Abschnitt „Quellen“ angezeigt wird.