Forscher entwickeln eine neue Methode, um die räumliche Entwicklung von Krebserkrankungen abzubilden

In einer kürzlich veröffentlichten Studie in Naturentwickelten die Forscher einen Arbeitsablauf zur Kartierung genetischer Klone, der sich auf die Technologie der basenspezifischen In-situ-Sequenzierung (BaSISS) konzentriert, um quantitative Karten mehrerer genetischer Klone von Krebszellen abzuleiten.

Lernen: Räumliche Genomik bildet die Struktur, Natur und Entwicklung von Krebsklonen ab. Bildnachweis: Lightspring/Shutterstock

Hintergrund

Krebsartige oder neoplastische Zellen sind dynamische Einheiten, die ihre Wechselwirkungen mit ihrer Mikroumgebung ständig verändern und neu gestalten. Diese Zellen haben mehrere subklonale Populationen, die genetisch verwandte, aber unterschiedliche Gruppen von Zellen sind.

Genomische Technologien wie die Gesamtgenomsequenzierung (WGS) haben zwar Subklone entdeckt, scheinen jedoch nicht in der Lage zu sein, ihre phänotypischen Eigenschaften und Wechselwirkungen innerhalb von Gewebeökosystemen zu entschlüsseln. Dies ist eine große Einschränkung, da alle Eigenschaften von Krebssubklonen Determinanten für Krebswachstum, -progression, -rezidiv oder nachteilige Folgen sind.

BaSISS-Workflow

Die BaSISS zielten auf Subklone ab, die durch einen WGS-abgeleiteten Stammbaum identifiziert wurden. BaSISS-mutationsspezifische Padlock-Sonden hybridisierten zunächst in situ mit komplementärer DNA (cDNA) von Mutanten- und Wildtyp-Allelen klondefinierender somatischer Varianten. Alle vollständig zielgerichtet komplementären Padlock-Sonden ligierten und bildeten geschlossene Kreise.

Anschließend detektierten Fluorophor-markierte Abfragesonden und zyklische Mikroskopie einzigartige vier bis fünf Nukleotide lange Reader-Barcodes von ligierten Sonden, die durch Rolling-Circle-Amplifikation amplifiziert wurden, was Multiplexing ermöglichte. Das Team verwendete mathematische Modellierung, um Klonkarten mit BaSISS-Signalen und den Klon-Genotypen zu erstellen.

Über das Studium

In der vorliegenden Studie entnahmen die Forscher acht Gewebeblöcke von zwei Patientinnen (P1 und P2), die sich einer chirurgischen Mastektomie wegen multifokalem Brustkrebs unterzogen hatten. Diese Gewebeproben umfassten drei histologische Stadien der frühen Krebsprogression: duktales Karzinom in situ (DCIS), invasiver Krebs und Lymphknotenmetastasen.

An drei Proben von P1, P1-Östrogenrezeptor (ER)1, P1-ER2 und P1-D1 identifizierten WGS-Experimente Mutationscluster, die mit sechs phylogenetischen Baumzweigen verbunden sind. BaSISS-Vorhängeschloss-Sonden zielten auf 51 Allele auf jedem phylogenetischen Baumzweig ab. Das Team identifizierte einen Subklon anhand einer Patientenkennung und der Farbe des entsprechenden phylogenetischen Baumknotens.

Insbesondere bezeichneten unterschiedliche Farben, die auf P1 bezeichnet sind, einen Knoten. B. P1-lila, P1-rot, P1-grau, P1-orange, P1-grün und P1-blau. Ebenso umfasste ein Subklon-Genotyp die Zweigmutationen, die sich ansammelten, wenn man sich von der Baumwurzel zum Subklon-Knoten bewegte. Zum Beispiel enthielt P1-Grün graue, blaue und grüne Verzweigungsmutationen.

Das Team untersuchte drei Proben von primärem Brustkrebs (PBC) mit gemischter invasiver und DCIS-Histologie: P1-ER1, P1-ER2 und P2-dreifach-negativ (TN)1, um zu zeigen, dass BaSISS die Entwicklung unterschiedlicher Krebsstadien über ganze Gewebeschnitte hinweg aufzeichnen konnte . Darüber hinaus integrierten die Forscher räumliche Daten, um festzustellen, wie phänotypische Veränderungen mit genetischen Zustands- und histologischen Zustandsübergängen zusammenhängen.

Es ist bekannt, dass DCIS genetisch heterogen ist, aber wie sich DCIS-Klone organisieren und durch das breitere Kanalsystem wachsen, bleibt unverständlich. Also untersuchte das Team drei DCIS-Proben von P1 (P1-D1, P1-D2 und P1-D3), die eine Gewebeoberfläche von 224 mm2 überspannten. Schließlich führte das Team eine räumliche Genexpressionsanalyse mit gezielter In-situ-Sequenzierung (ISS) durch.

Studienergebnisse

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Nahezu 97 % der detektierten BaSISS-Spotsignale wurden in verständliche Barcodes umgewandelt. Seine mittlere zielspezifische Abdeckung war auf 300 mm2 Brustgewebe 13.000-mal höher. Darüber hinaus zeigten die von BaSISS abgeleiteten Varianten-Allelfraktionen eine starke Verknüpfung über Wiederholungsexperimente an seriellen Gewebeschnitten hinweg, was ihre quantitative Reproduzierbarkeit zeigt. Die gemäß ihrem subklonalen Mutationszweig gefärbten BaSISS-Signale zeigten einen visuellen Einblick in die subklonale Wachstumsstruktur.

Der Klon-Mapping-Algorithmus passte die beobachteten Allelhäufigkeiten auch diskret für eine Reihe von systematischen Abweichungen an (z. B. unterschiedliche Empfindlichkeit der BaSISS-Sonde). Die BaSISS-modellierten Allelfrequenzen stimmten jedoch stark mit den Validierungsdaten der Laser-Capture-Mikrodissektion (LCM) und WGS überein.

In Übereinstimmung mit Massen-WGS-Daten entdeckte BaSISS zwei bis vier Subklone pro PBC. Die quantitative Untersuchung ergab, dass einzelne Subklone räumliche Muster bildeten, die mit dem histologischen Fortschreiten von Krebszuständen in Beziehung standen. Beispielsweise war in P1-ER2 eine Region mit Hyperplasie genetisch nicht mit Krebs verwandt, wie durch LCM-WGS bestätigt wurde. Bei allen PBC waren die genetischen und histologischen Progressionsmodelle weitgehend stabil. Der invasive Krebs bestand hauptsächlich aus Zellen des zuletzt divergierten Subklons.

Umgekehrt kolokalisierten frühere divergierende Klone ganz oder teilweise mit dem DCIS. Ein Subklon in jeder PBC umfasste jedoch sowohl DCIS als auch invasive Histologie. Es deutete darauf hin, dass auch getrennte histologische und genetische Progressionsstadien existieren könnten. Beispiele umfassen Klon P1-rot in P1-ER1 und Klon P1-violett in P1-ER2.

In Bezug auf phänotypische Veränderungen, die mit einer Krebsinvasion einhergehen, beobachteten die Forscher, dass Phosphatase- und Tensin-Homolog (PTEN)-mutierte Klonregionen eine dichtere Ki-67-Immunhistochemie (IHC)-Kernfärbung aufwiesen als Wildtypregionen. Die Hochregulierung von Ki-67, einem weiteren genetischen Klon, stand in zeitlichem Zusammenhang mit dem Erwerb einer PTEN-Mutation und ging der Invasion voraus.

P1-Orange-Epithelzellen zeigten eine höhere Expression der zellzyklusregulierenden Onkogene Cyclin D1 (CCND1) und Cyclin B1 (CCNB1) sowie des Onkogens Zinkfingerprotein 3 (ZNF703), die mit unerwünschten klinischen Ergebnissen in Verbindung gebracht wurden. Insgesamt waren architektonische und nukleäre Erscheinungen und Genexpressionsprofile bemerkenswert linienspezifisch, und ihre unterschiedlichen Muster konnten auch räumlich visualisiert werden.

Eine Analyse der Probe P2-LN1 mit BaSISS entdeckte zwei Klone (P2-blau und P2-orange), die räumlich getrennte Muster bildeten. Die histologische Annotation unter Verwendung von Hämatoxylin&Eosin (H&E), Lymphozyten-Common-Antigen (CD45) und Pan-Cytokeratin-Färbungen identifizierte multiple metastatische Krebswachstumsmuster. Die Autoren stellten starke Assoziationen zwischen diesen beiden entdeckten Klonen und ihren histologischen Wachstumsmustern fest.

Darüber hinaus stellten sie fest, dass klonspezifische Genexpressionsmuster von 17/91-Genen innerhalb mehrerer, räumlich unterschiedlicher Ausdehnungen über mehr als 1 cm2 Tumorgewebe rekapituliert wurden. Insgesamt bildet der BaSISS-Klon räumlich verwandte genetische Variationen in Mikroumgebungen auf einzelne Klone ab.

Schlussfolgerungen

LCM, eine histologiegesteuerte Probenahmetechnik, liefert keine unvoreingenommene Darstellung der Krebs-Subklon-Gebiete, insbesondere über ganze Tumorschnitte hinweg. BaSISS hingegen untersuchte große Gewebeschnitte im Quadratzentimeterbereich, was es ermöglichte, ganze Querschnitte kleinerer Tumore zu untersuchen. Es ist auch relativ kostengünstig und stützt sich nicht ausschließlich auf WGS-basierte Methoden.

Zusammenfassend lässt sich sagen, dass BaSISS dank seiner bemerkenswerten Fähigkeit, mehrere unterschiedliche Krebssubklone räumlich zu lokalisieren und sie sogar molekular zu charakterisieren, eine wertvolle Ergänzung des Spatial-Omics-Toolkits ist. In Zukunft könnte seine weit verbreitete Anwendung dazu beitragen, aufzudecken, wie Krebs in verschiedenen Geweben wächst, was wiederum dazu beitragen könnte, die unglückseligen Subklone aufzuspüren, die nachteilige klinische Ergebnisse verursachen.

Referenz:

• Lomakin, A. et al. (2022) „Räumliche Genomik bildet die Struktur, Natur und Entwicklung von Krebsklonen ab“, Nature. doi: 10.1038/s41586-022-05425-2. https://www.nature.com/articles/s41586-022-05425-2

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