Der MIT -Durchbruch ermöglicht eine schnelle und gleichmäßige Proteinmarkierung in 3D -Geweben

Eine neue Technologie, die bei MIT entwickelt wurde, ermöglicht es Wissenschaftlern, Proteine ​​in Millionen einzelner Zellen in vollständig intakten 3D -Geweben mit beispielloser Geschwindigkeit, Gleichmäßigkeit und Vielseitigkeit zu kennzeichnen. Mit der Technologie konnte das Team an einem einzigen Tag reichlich Ganzkernhirn und andere große Gewebeproben kennzeichnen. In ihrer neuen Studie in Naturbiotechnologie, Sie zeigen auch, dass die Fähigkeit, Proteine ​​mit Antikörpern auf Einzelzellenebene über ganze Gehirne zu kennzeichnen, Erkenntnisse aufzeigen kann, die von anderen weit verbreiteten Markierungsmethoden versteckt sind.

Das Profilieren der Proteine, die Zellen erstellen, ist ein Grundnahrungsmittel für Studien in Biologie, Neurowissenschaften und verwandten Feldern oder Behandlung. So sehr die Mikroskopie- und Markierungstechnologien fortgeschritten sind und es unzählige Entdeckungen ermöglicht. Wissenschaftler fehlten immer noch eine zuverlässige und praktische Art, die Proteinexpression auf der Ebene von Millionen von dicht gepackten einzelnen Zellen in ganz 3D -intakten Geweben wie einem gesamten Maushirn oder einem gesamten Maushirn oder eines Maus -Gehirns oder -Bereichs zu verfolgen eine volle Region eines menschlichen Gehirns. Wissenschaftler waren häufig auf dünne Gewebeschnitte unter Folien beschränkt, und hatten daher keine Werkzeuge, um die zelluläre Proteinexpression in den gesamten, verbundenen Systemen, in denen sie auftritt, gründlich zu schätzen.

Herkömmlicherweise erfordert die Untersuchung der Moleküle in Zellen das Dissoziieren von Gewebe in Einzelzellen oder das Schneiden in dünne Schnitte, da Licht und Chemikalien, die für die Analyse erforderlich sind, nicht tief in Gewebe eindringen können. Unser Labor entwickelte Technologien wie Klarheit und Schild, die die Untersuchung ganzer Organe ermöglichen, indem wir sie transparent machen. Wir brauchten nun eine Möglichkeit, ganze Organe chemisch zu kennzeichnen, um nützliche wissenschaftliche Erkenntnisse zu gewinnen. Stellen Sie sich vor, Sie marinieren ein dickes Steak, indem Sie ihn einfach in die Sauce tauchen. Die äußeren Schichten absorbieren die Marinade schnell und intensiv, während die inneren Schichten weitgehend unberührt bleiben, es sei denn, das Fleisch wird über einen längeren Zeitraum eingeweicht. Das gleiche Prinzip gilt für die chemische Verarbeitung von Geweben: Wenn Zellen innerhalb eines Gewebes nicht gleichmäßig verarbeitet werden, können sie nicht quantitativ verglichen werden. Die Herausforderung ist für die Proteinmarkierung noch größer, da die Chemikalien, die wir zur Kennzeichnung verwenden, hunderte Male größer sind als die in Marinaden. Infolgedessen kann es Wochen dauern, bis diese Moleküle in intakte Organe diffundieren, wodurch eine gleichmäßige chemische Verarbeitung von Organgewebe praktisch unmöglich und extrem langsam wird. „

Kwanghun Chung, Senior Autor, Associate Professor am Picower Institute for Learning and Memory, die Abteilungen für Chemieingenieurwesen sowie Gehirn- und Kognitiven Wissenschaften sowie Institut für Medizintechnik und Wissenschaft am MIT

Der neue Ansatz mit dem Namen „Curve“ stellt ein wichtiges Vorjahresjahre in der Herstellung dieses Ziels dar, indem ein grundlegend neuer Ansatz zur gleichmäßigen Verarbeitung großer und dichtes Gewebe des Ganzen nachgewiesen wird. In der Studie erklären die Forscher, wie sie die technischen Hindernisse durch eine Umsetzung der Kurve namens „Eflash“ überwunden haben, und liefern reichliche lebendige Demonstrationen der Technologie, einschließlich der Erkenntnisse neuer neurowissenschaftlicher Erkenntnisse.

„Dies ist ein bedeutender Sprung, insbesondere im Hinblick auf die tatsächliche Leistung der Technologie“, sagte der Co-Lead-Autor Dae Hee Yun, ein ehemaliger MIT-Doktorand und jetzt Senior Application Engineer bei LifeCanvas Technologies, einem Startup-Unternehmen Chung, das sich verbreitet, um sich zu verbreiten Die Werkzeuge, die sein Labor erfindet. Der andere Hauptautor der Zeitung ist Young-Gyun Park, ein ehemaliger Postdoktorand-Forscher MIT, der heute Assistenzprofessor bei Kaist in Südkorea ist.

Kluge Chemie

Der grundlegende Grund, warum große 3D -Gewebeproben gleichmäßig schwer zu kennzeichnen sind, ist, dass Antikörper sehr langsam in Gewebe eindringen, aber schnell an ihre Zielproteine ​​binden. Der praktische Effekt dieser Geschwindigkeitsfehlanpassung besteht darin, dass das einfache Einweichen eines Gehirns in einem Bad von Antikörpern bedeutet, dass Proteine ​​am äußeren Rand des Gewebes intensiv gut markiert sind, aber praktisch keines der Antikörper findet Zellen und Proteine ​​tiefer im Inneren.

Um die Kennzeichnung zu verbessern, konzipierte das Team einen Weg-die konzeptionelle Essenz der Kurve, um die Geschwindigkeitsfehlanpassung zu lösen. Die Strategie bestand darin, das Tempo der Antikörperbindung kontinuierlich zu kontrollieren und gleichzeitig die Antikörperpermeation im gesamten Gewebe zu beschleunigen. Um herauszufinden, wie dies funktionieren und den Ansatz optimieren könnte, erstellten und führten sie eine ausgefeilte Rechensimulation, die es ihnen ermöglichte, verschiedene Einstellungen und Parameter zu testen, einschließlich unterschiedlicher Bindungsraten und Gewebedichten und -zusammensetzungen.

Dann machten sie sich vor, ihren Ansatz in realen Geweben zu implementieren. Ihr Ausgangspunkt war eine frühere Technologie namens „Switch“, in der Chungs Labor einen Weg entwickelte, die Antikörperbindung vorübergehend auszuschalten, die Antikörper das Gewebe durchdringen zu lassen und dann die Bindung wieder einzuschalten. So wie es funktioniert hat, stellte das Team fest, dass es erhebliche Verbesserungen geben könnte, wenn die Antikörperbindungsgeschwindigkeit ständig kontrolliert werden könnte, aber die im Switch verwendeten Chemikalien waren für eine solche laufende Behandlung zu hart. Das Team untersuchte also eine Bibliothek mit ähnlichen Chemikalien, um eine zu finden, die eine subtilere und kontinuierlichere Antikörperbindungsgeschwindigkeit auf subtile Weise und kontinuierlich drosseln könnte. Sie fanden heraus, dass Deoxycholsäure ein idealer Kandidat war. Unter Verwendung dieser Chemikalie konnte das Team nicht nur die Antikörperbindung modulieren, indem die Konzentration der Chemikalie variiert, sondern auch durch Variation des pH -Werts (oder Säure) des Markierungsbades.

Um die Antikörperbewegung durch Gewebe zu beschleunigen, verwendete das Team eine weitere frühere Technologie, die im Chung Lab: Stochastic Electrotransport erfunden wurde. Diese Technologie beschleunigt die Dispersion von Antikörpern durch das Gewebe durch Anwenden von elektrischen Feldern.

Die Implementierung dieses Eflash -Systems mit beschleunigter Dispersion mit kontinuierlich modifizierbarer Bindungsgeschwindigkeit führte zu einer Vielzahl von Kennzeichnungserfolgen, die in der Arbeit demonstrieren. Insgesamt berichtete das Team, mehr als 60 verschiedene Antikörper zu verwenden, um Proteine ​​in Zellen über ganze Gehirne von Mäusen und Ratten zu kennzeichnen. ganze Mausembryonen; andere ganze Mausorgane, einschließlich Lunge und Herz; und Blöcke des Gehirngewebes von größeren Tieren, einschließlich Menschen.

Insbesondere wurde jedes dieser Exemplare innerhalb eines Tages markiert, eine „ultraschnelle“ Geschwindigkeit für ganze, intakte Organe, sagten die Autoren. Darüber hinaus erforderten unterschiedliche Vorbereitungen keine neuen Optimierungsschritte.

Wertvolle Visualisierungen

Unter der Art und Weise, wie das Team Eflash auf den Test stellte, war es, seine Markierung mit einer anderen häufig verwendeten Methode zu vergleichen: genetisch technische Zellen, um zu fluoreszieren, wenn das Gen für ein interessierendes Protein transkribiert wird. Die genetische Methode erfordert keine Verbreitung von Antikörpern im gesamten Gewebe, kann jedoch anfällig für Diskrepanzen sein, da die Berichterstattung über Gentranskription und die tatsächliche Proteinproduktion nicht genau dasselbe sind. Yun fügte hinzu, dass die Antikörpermarkierung zwar zuverlässig und sofort über das Vorhandensein eines Zielproteins berichtet, aber die genetische Methode viel weniger unmittelbar und anhaltend sein kann und auch dann fluorescing, selbst wenn das tatsächliche Protein nicht mehr vorhanden ist.

In der Studie verwendete das Team beide Arten der Kennzeichnung gleichzeitig in Proben. Als sie die Beschriftungen auf diese Weise visualisierten, sahen sie viele Beispiele, in denen sich eine Antikörpermarkierung und die genetische Markierung stark unterschiedlich waren. In einigen Bereichen von Mausgehirnen fanden sie, dass zwei Drittel der Neuronen, die PV exprimierten (ein Protein, das in bestimmten inhibitorischen Neuronen spürbar) nach Antikörpermarkierung exprimiert wurde, keine genetisch basierte Fluoreszenz zeigte. In einem anderen Beispiel berichtete nur ein winziger Teil von Zellen, die die Expression über die genetische Methode eines Proteins namens Chat berichteten, es auch über eine Antikörpermarkierung. Mit anderen Worten, es gab Fälle, in denen die genetische Markierung im Vergleich zur Antikörpermarkierung sowohl die stark unterberichtete oder überarbeitete Proteinexpression stark gemeldet hat.

Die Forscher wollen nicht den klaren Wert der Verwendung der genetischen Berichterstellungsmethoden aufspannen, sondern deuten stattdessen darauf hin, dass auch die Verwendung der organ-weiten Antikörpermarkierung, wie Eflash es zulässt, dazu beitragen kann, diese Daten in einen reichhaltigeren, vollständigeren Kontext zu bringen. Angesichts der Tatsache, dass sie Fälle einer signifikanten Überberichterstattung der PV-Expression bei Mäusen (und signifikanten Variationen zwischen einzelnen Mäusen) sah .

„Unsere Entdeckung eines großen regionalisierten Verlusts von PV-immunreaktiven Neuronen bei gesunden erwachsenen Mäusen und mit hoher individueller Variabilität unterstreicht die Bedeutung von ganzheitlichen und unvoreingenommenen Phänotypen“, schrieben die Autoren.

Oder wie Yun es ausdrückte, sind die beiden verschiedenen Kennzeichnungsarten „zwei verschiedene Tools für den Job“.

Zusätzlich zu Yun, Park und Chung sind die anderen Autoren der Papier Jae Hun Cho, Lee Kamentsky, Nicholas Evans, Nicholas Dinapoli, Katherine Xie, Seo Woo Choi, Alexandre Albanese, Yuxuan Tian, ​​Chang Ho Sohn, Qiangge Zhang, Minyoung Kim, Minyoung Kim, Justin Swaney, Webster Guan, Juhyuk Park, Gabi Drummond, Heejin Choi, Luzdary Ruelas und Guoping Feng.

Die Finanzierung der Studie stammt aus dem Burroughs Wellcome Fund, dem Searle Scholars Program, einem Packard Award in Science and Engineering, einem Narsad Young Investigator Award, der McKnight Foundation, der Freedom Together Foundation, dem Picower Institute for Learning and Memory, The NCSoft Cultural Foundation und die National Institutes of Health.

Quellen: