Neue tARC-seq-Methode verbessert die Präzision bei der Verfolgung von SARS-CoV-2-Mutationen

In einer kürzlich in Nature Microbiology veröffentlichten Studie entwickelten Forscher einen gezielten, genauen Ribonukleinsäure (RNA)-Konsenssequenzierungsansatz (tARC-seq), um die Mutationshäufigkeit und -typen des schweren akuten respiratorischen Syndroms Coronavirus 2 (SARS-CoV-2) in Zellkulturen genau zu bestimmen und klinische Proben.

Hintergrund

SARS-CoV-2 repliziert sich über RNA-abhängige RNA-Polymerasen (RdRp), die fehleranfällig sind. Die Überwachung von Replikationsfehlern ist für das Verständnis der Virusentwicklung von entscheidender Bedeutung. Die vorhandenen Ansätze reichen jedoch nicht aus, um seltene De-novo-Ribonukleinsäureveränderungen zu identifizieren.

Während der Coronavirus-Pandemie 2019 (COVID-19) lagen die SARS-CoV-2-Mutationsraten zwischen 10−6 und 10−4 pro Base und Zelle. Die Aktivität des Exonuklease-Korrekturlesens steigert die Mutationsraten und führt zu durchschnittlich zwei Mutationen in jedem Genom pro Monat.

Über die Studie

In der vorliegenden Studie haben Forscher tARC-seq erstellt, um die Mechanismen von Replikationsfehlern zu untersuchen, die sich auf die Divergenz von SARS-CoV-2 auswirken.

Der tARC-seq-Ansatz kombiniert ARC-seq-Eigenschaften mit Hybrid-Erfassungstechnologie, um Ziele zu verbessern und eine detaillierte Variantenabfrage dieser Proben zu ermöglichen.

Die Forscher nutzten tARC-seq, um RNA-Variationen im ursprünglichen SARS-CoV-2-Wildtyp (WT)-Stamm, den SARS-CoV-2-Alpha- und Omicron-Varianten sowie klinischen und Omicron-Proben zu entdecken.

Die Forscher sequenzierten SARS-CoV-2-Wildtyp-RNA nach 4,0 Infektionszyklen und erzeugten 9,0 × 105 Plaque-bildende Einheiten (pf.u.) SARS-CoV-2-RNA. Sie fügten hinzu E coli Messenger-RNA (mRNA) als Enzymträger zur Herstellung von Bibliotheken. Hybrid Capture entdeckte E. coli-RNA in der Genbibliothek, die die Forscher einzeln untersuchten und als interne Kontrollen verwendeten.

Um Selektionen in tARC-Sequenzierungsdaten weiter zu untersuchen, kartierten die Forscher die durch tARC-Sequenzierung identifizierten Häufigkeiten von Non-Sense-Typ-, Synonym- und Nicht-Synonym-Varianten im Monostrukturprotein 12 (nsp12), einem kritischen Gen, das für SARS-CoV-2 kodiert RdRp.

Sie ermittelten die Evolutionary Action (EA)-Bewertungen und Variationshäufigkeiten für Nonsense-Typ- und nicht-synonyme Einzelnukleotid-Polymorphismen (SNPs), die in SARS-CoV-2 Spike (S) und nsp12 gefunden wurden. Sie berechneten auch die durchschnittliche Mutationshäufigkeit der offenen Leserahmen (ORFs) im Wildtyp-Virus, aufgeschlüsselt nach Mutationstyp und Basenveränderungen.

Die Forscher untersuchten die zufällige Verteilung von RNA-Varianten im SARS-CoV-2-Genom mithilfe ortsbasierter Schätzungen und Nukleotididentitätsanalysen. Sie verwendeten tARC-seq auch an zwei klinischen Proben, um nach De-novo-Mutationen zu suchen, die durch spontane Infektionen verursacht wurden.

Sie ordneten die zehn häufigsten C>TT- und G>AA-Mutationen bekannten A3A-Editierungsstellen im Wildtyp-Virus zu. Die Forscher untersuchten alle SID-Vorkommen mit ≥2 Nukleotiden der Komplementarität zwischen Donor- und Akzeptorstellen stromabwärts in WT, Alpha und Omicron. Sie untersuchten die genomweite Prävalenz von TC>TT-Mutationen in WT-Vero-Zellen.

Ergebnisse

Forscher fanden 2,7 × 10−5 (mittlere) De-novo-Fehler pro Zyklus beim SARS-CoV-2-Virus, wobei C>T-Verzerrungen nicht in erster Linie auf die Bearbeitung des mRNA-editierenden Enzyms Apolipoprotein B, katalytisches Polypeptid (APOBEC) zurückzuführen sind.

Sie identifizierten je nach niedriger oder hoher GC-Konzentration kühle und heiße Bereiche im gesamten Genom und hoben Transkriptionsregulationsregionen als Orte hervor, die anfälliger für Fehler sind. Der tARC-seq-Ansatz ermöglicht die Erkennung von Vorlagenwechseln wie Löschungen, Einfügungen und komplizierten Änderungen.

Das WT-Virus weist 1,1 × 10–4 RNA-Variationen pro Base auf, wobei Basensubstitutionen den Großteil ausmachen (8,4 × 10–5), gefolgt von Insertionen (2,5 × 10–6) und Deletionen (2,1 × 10–5). Die G > A- und C > T-Übergänge dominieren die Virusmutationslandschaft und machen 9,0 % bzw. 44 % aller Vorkommen aus.

Das Mutationsspektrum und die Häufigkeit von Wildtyp-SARS-CoV-2-Off-Target-Reads unterscheiden sich von denen von E. coli, was zeigt, dass es sich bei diesen Mutationsereignissen um echte virale Veränderungen und nicht um Artefakte der Bibliotheksvorbereitung handelt.

Zufällige Verteilungen und vergleichbare Raten aller drei nsp12-Mutationstypen legen nahe, dass es sich bei den meisten durch tARC-Sequenzierung gefundenen RNA-Variationen um Replikationsfehler vom De-novo-Typ handelte. Die Forscher fanden keine Unterschiede in der Variantenhäufigkeit zwischen den SNPs mit niedrigen evolutionären Aktionswerten (geschätzte neutrale Effekte) und denen mit hohen EA-Werten (geschätzte schädliche Auswirkungen) über den Basissubstitutionsbereich, was darauf hindeutet, dass die Selektion nur einen begrenzten Einfluss hat.

Die Variantenraten variieren erheblich zwischen den Standorten, wobei 643 Loci in WT-Virusduplikaten erheblich höhere Basensubstitutionshäufigkeiten aufweisen und 80 in beiden WT-Replikaten wiederkehren.

Die Forscher fanden keine Überlappung zwischen den C>TT-Hotspots der tARC-Sequenzierung mit der höchsten Frequenz und den A3A-Editierungsregionen im Wildtyp-Virus. Die C>TT-Frequenzen der tARC-Sequenzierung in A3A-Editierungsregionen waren um ein bis zwei Größenordnungen niedriger als die C>TT-Frequenzen der C>TT-Hotspots der tARC-Sequenzierung mit der höchsten Frequenz.

In der Studie wurde tARC-seq hervorgehoben, ein spezieller Sequenzierungsansatz zur Untersuchung der Replikationsfehler, die die SARS-CoV-2-Divergenz beeinflussen. Dieser Ansatz liest selektiv bestimmte RNA-Moleküle, um eine Konsenssequenz zu generieren, die es Forschern ermöglicht, kleinere Unterschiede und Fehler während der Virusreplikation zu erkennen und zu bewerten.

Es kann auch De-novo-Insertionen und -Deletionen in SARS-CoV-2 erkennen, die auf eine Zellkulturinfektion zurückzuführen sind, was die Ergebnisse der weltweiten Pandemiesequenzierung bestätigt.

Die Studie ergab außerdem, dass SARS-CoV-2 über Fähigkeiten zum Korrekturlesen von Exonukleasen verfügt, die zum Verständnis der entscheidenden Funktion von ExoN beitragen können.

Quellen: