Нов метод tARC-seq подобрява прецизността при проследяване на мутации на SARS-CoV-2

Нов метод tARC-seq подобрява прецизността при проследяване на мутации на SARS-CoV-2

В скорошно проучване, публикувано в Nature Microbiology, изследователите разработиха целенасочен, точен подход за консенсусно секвениране на рибонуклеинова киселина (РНК) (tARC-seq) за точно определяне на честотите и видовете мутации на тежък остър респираторен синдром на коронавирус 2 (SARS-CoV-2) в клетъчна култура и клинични проби.

фон

SARS-CoV-2 се репликира чрез РНК-зависими РНК полимерази (RdRp), които са податливи на грешки. Наблюдението на грешките при репликация е от решаващо значение за разбирането на еволюцията на вируса. Съществуващите подходи обаче не са достатъчни за идентифициране на редки de novo изменения на рибонуклеинова киселина.

По време на пандемията от коронавирусната болест 2019 (COVID-19), нивата на мутация на SARS-CoV-2 варираха от 10−6 до 10−4 на база на клетка. Екзонуклеазната коригираща активност увеличава нивата на мутации, което води до средно две мутации във всеки геном на месец.

Относно изследването

В настоящото проучване изследователите създадоха tARC-seq, за да изследват механизмите на грешки при репликация, засягащи дивергенцията на SARS-CoV-2.

Подходът tARC-seq съчетава функциите на ARC-seq с хибридна технология за придобиване, за да подобри целите и да даде възможност за подробно запитване на варианти на тези проби.

Изследователите са използвали tARC-seq за откриване на вариации на РНК в оригиналния щам от див тип (WT) SARS-CoV-2, вариантите на SARS-CoV-2 алфа и Omicron, както и клинични проби и проби от Omicron.

Изследователите секвенираха РНК от див тип на SARS-CoV-2 след 4,0 цикъла на инфекция и генерираха 9,0 × 105 образуващи плака единици (pf.u.) РНК на SARS-CoV-2. Те добавихаE. coliMessenger RNA (mRNA) като ензимен носител за производството на библиотеки. Хибридното улавяне открива РНК на E. coli в генната библиотека, която изследователите изследват индивидуално и използват като вътрешни контроли.

За по-нататъшно изследване на селекциите в данните за секвениране на tARC, изследователите картографираха честотите на безсмислен тип, синонимни и несинонимни варианти, идентифицирани чрез секвениране на tARC в моноструктурен протеин 12 (nsp12), критичен ген, кодиращ SARS-CoV-2 RdRp.

Те определиха резултатите за еволюционно действие (EA) и честотите на вариациите за безсмислени и несинонимни единични нуклеотидни полиморфизми (SNP), открити в SARS-CoV-2 Spike (S) и nsp12. Те също така изчисляват средната честота на мутация на отворените рамки за четене (ORFs) в вируса от див тип, разбита по тип мутация и промени в основата.

Изследователите са изследвали случайното разпределение на вариантите на РНК в генома на SARS-CoV-2, използвайки оценка, базирана на местоположението, и анализ на нуклеотидната идентичност. Те също така използваха tARC-seq върху две клинични проби, за да търсят de novo мутации, причинени от спонтанни инфекции.

Те присвоиха десетте най-често срещани C>TT и G>AA мутации на известни места за редактиране на A3A в вируса от див тип. Изследователите са изследвали всички случаи на SID с ≥2 нуклеотида на комплементарност между донорни и акцепторни места надолу по веригата в WT, Alpha и Omicron. Те изследваха разпространението на TC>TT мутации в генома в клетките на WT Vero.

Резултати

Изследователите откриха 2,7 × 10−5 (средни) de novo грешки на цикъл при вируса SARS-CoV-2, като отклоненията на C>T не се дължат главно на редактирането на каталитичния полипептид аполипопротеин B (APOBEC), редактиращ иРНК.

Те идентифицираха хладни и горещи региони в генома в зависимост от ниската или високата концентрация на GC, подчертавайки транскрипционните регулаторни региони като места, по-податливи на грешки. Подходът tARC-seq позволява откриване на промени в шаблона, като изтривания, вмъквания и сложни промени.

Вирусът WT има 1,1 × 10-4 вариации на РНК на база, като базовите замествания представляват по-голямата част (8,4 × 10-5), последвани от вмъквания (2,5 × 10-6) и делеции (2,1 × 10-5). Преходите G > A и C > T доминират пейзажа на вирусната мутация, представлявайки съответно 9,0% и 44% от всички случаи.

Мутационният спектър и честотата на дивия тип SARS-CoV-2 извън целта са различни от тези на E. coli, което показва, че тези мутационни събития са истински вирусни промени, а не артефакти от подготовката на библиотеката.

Случайни разпределения и сравними нива на всичките три вида мутация на nsp12 предполагат, че повечето вариации на РНК, открити чрез tARC секвениране, са грешки на репликация от de novo тип. Изследователите не откриха разлики във вариантните честоти между SNPs с ниски еволюционни стойности на действие (изчислени неутрални ефекти) и тези с високи стойности на EA (изчислени вредни ефекти) в диапазона на базовото заместване, което предполага, че селекцията има само ограничено влияние.

Процентите на вариантите варират значително между сайтовете, като 643 локуса показват значително по-високи честоти на базово заместване в дубликати на WT вирус и 80, повтарящи се в двата WT реплики.

Изследователите не откриха припокриване между горещите точки на C>TT с най-висока честота от секвенирането на tARC и регионите за редактиране на A3A в вируса от див тип. Честотите на tARC секвениране на C>TT в областите за редактиране на A3A бяха с един до два порядъка по-ниски от горещите точки на tARC секвениране на C>TT с най-висока честота.

Проучването подчертава tARC-seq, специализиран подход за секвениране за изследване на грешките при репликация, които влияят на дивергенцията на SARS-CoV-2. Този подход селективно чете определени РНК молекули, за да генерира консенсусна последователност, което позволява на изследователите да открият и оценят незначителни разлики и грешки по време на репликацията на вируса.

Той може също да открие de novo инсерции и делеции в SARS-CoV-2 в резултат на инфекция на клетъчна култура, потвърждавайки резултатите от секвенирането на глобалната пандемия.

Проучването установи също, че SARS-CoV-2 има възможности за коригиране на екзонуклеаза, което може да помогне за разбирането на решаващата функция на ExoN.

източници: