El nuevo método tARC-seq mejora la precisión en el seguimiento de las mutaciones del SARS-CoV-2

El nuevo método tARC-seq mejora la precisión en el seguimiento de las mutaciones del SARS-CoV-2

En un estudio reciente publicado en Nature Microbiology, los investigadores desarrollaron un enfoque de secuenciación de consenso de ácido ribonucleico (ARN) preciso y específico (tARC-seq) para determinar con precisión las frecuencias y tipos de mutaciones del coronavirus 2 (SARS-CoV-2) del síndrome respiratorio agudo grave en cultivos celulares y muestras clínicas.

fondo

El SARS-CoV-2 se replica mediante ARN polimerasas dependientes de ARN (RdRp), que son propensas a errores. Monitorear los errores de replicación es fundamental para comprender la evolución del virus. Sin embargo, los enfoques existentes no son suficientes para identificar alteraciones raras de novo del ácido ribonucleico.

Durante la pandemia de la enfermedad por coronavirus de 2019 (COVID-19), las tasas de mutación del SARS-CoV-2 oscilaron entre 10-6 y 10-4 por base por célula. La actividad correctora de exonucleasas aumenta las tasas de mutación, lo que resulta en un promedio de dos mutaciones en cada genoma por mes.

Sobre el estudio

En el presente estudio, los investigadores crearon tARC-seq para investigar los mecanismos de los errores de replicación que afectan la divergencia del SARS-CoV-2.

El enfoque tARC-seq combina características de ARC-seq con tecnología de adquisición híbrida para mejorar los objetivos y permitir una interrogación variante detallada de estas muestras.

Los investigadores utilizaron tARC-seq para detectar variaciones de ARN en la cepa original de tipo salvaje (WT) del SARS-CoV-2, las variantes alfa y Omicron del SARS-CoV-2, y muestras clínicas y Omicron.

Los investigadores secuenciaron el ARN de tipo salvaje del SARS-CoV-2 después de 4,0 ciclos de infección y generaron 9,0 × 105 unidades formadoras de placas (pf.u.) de ARN del SARS-CoV-2. ellos agregaronEscherichia coliARN mensajero (ARNm) como portador enzimático para la producción de bibliotecas. La captura de híbridos detectó ARN de E. coli en la biblioteca de genes, que los investigadores examinaron individualmente y utilizaron como controles internos.

Para investigar más a fondo las selecciones en los datos de secuenciación de tARC, los investigadores mapearon las frecuencias de variantes sin sentido, sinónimas y no sinónimas identificadas mediante la secuenciación de tARC en la proteína monoestructural 12 (nsp12), un gen crítico que codifica el SARS-CoV-2 RdRp.

Determinaron las puntuaciones de acción evolutiva (EA) y las frecuencias de variación para los polimorfismos de un solo nucleótido (SNP) sin sentido y no sinónimos que se encuentran en SARS-CoV-2 Spike (S) y nsp12. También calcularon la frecuencia de mutación promedio de los marcos de lectura abiertos (ORF) en el virus de tipo salvaje, desglosada por tipo de mutación y cambios de base.

Los investigadores examinaron la distribución aleatoria de variantes de ARN en el genoma del SARS-CoV-2 mediante estimación basada en la ubicación y análisis de identidad de nucleótidos. También utilizaron tARC-seq en dos muestras clínicas para buscar mutaciones de novo causadas por infecciones espontáneas.

Asignaron las diez mutaciones C>TT y G>AA más comunes a sitios de edición A3A conocidos en el virus de tipo salvaje. Los investigadores examinaron todas las apariciones de SID con ≥2 nucleótidos de complementariedad entre los sitios donantes y aceptores aguas abajo en WT, Alpha y Omicron. Examinaron la prevalencia en todo el genoma de mutaciones TC>TT en células WT Vero.

Resultados

Los investigadores encontraron 2,7 × 10−5 (media) errores de novo por ciclo en el virus SARS-CoV-2, y los sesgos C>T no se deben principalmente a la edición del polipéptido catalítico de la apolipoproteína B de la enzima de edición de ARNm (APOBEC).

Identificaron regiones frías y calientes en todo el genoma dependiendo de la concentración alta o baja de GC, destacando las regiones reguladoras de la transcripción como sitios más propensos a errores. El enfoque tARC-seq permite la detección de cambios en la plantilla, como eliminaciones, inserciones y cambios complicados.

El virus WT tiene 1,1 × 10-4 variaciones de ARN por base, siendo las sustituciones de bases la mayoría (8,4 × 10-5), seguidas de inserciones (2,5 × 10-6) y eliminaciones (2,1 × 10-5). Las transiciones G > A y C > T dominan el panorama de mutaciones virales y representan el 9,0 % y el 44 % de todas las apariciones, respectivamente.

El espectro de mutación y la frecuencia de las lecturas fuera del objetivo del SARS-CoV-2 de tipo salvaje son diferentes de los de E. coli, lo que demuestra que estos eventos de mutación son verdaderos cambios virales y no artefactos de la preparación de la biblioteca.

Las distribuciones aleatorias y las tasas comparables de los tres tipos de mutaciones de nsp12 sugieren que la mayoría de las variaciones de ARN encontradas mediante la secuenciación de tARC fueron errores de replicación de novo. Los investigadores no encontraron diferencias en las frecuencias de variantes entre los SNP con valores de acción evolutiva bajos (efectos neutrales estimados) y aquellos con valores altos de EA (efectos nocivos estimados) en todo el rango de sustitución de bases, lo que sugiere que la selección tiene solo una influencia limitada.

Las tasas de variantes varían significativamente entre sitios, con 643 loci que muestran frecuencias de sustitución de bases significativamente más altas en duplicados de virus WT y 80 recurrentes en ambas réplicas de WT.

Los investigadores no encontraron ninguna superposición entre los puntos críticos C>TT de mayor frecuencia de la secuenciación tARC y las regiones de edición A3A en el virus de tipo salvaje. Las frecuencias C>TT de secuenciación tARC en las regiones de edición A3A fueron de uno a dos órdenes de magnitud más bajas que los puntos de acceso C>TT de secuenciación tARC de mayor frecuencia.

El estudio destacó tARC-seq, un enfoque de secuenciación especializado para investigar los errores de replicación que influyen en la divergencia del SARS-CoV-2. Este enfoque lee selectivamente ciertas moléculas de ARN para generar una secuencia de consenso, lo que permite a los investigadores detectar y evaluar diferencias y errores menores durante la replicación del virus.

También puede detectar inserciones y eliminaciones de novo en el SARS-CoV-2 resultantes de una infección en cultivos celulares, lo que confirma los resultados de la secuenciación de una pandemia global.

El estudio también encontró que el SARS-CoV-2 tiene capacidades de corrección de exonucleasas, lo que puede ayudar a comprender la función crucial de ExoN.

Fuentes: