Uusi tARC-seq-menetelmä parantaa tarkkuutta SARS-CoV-2-mutaatioiden jäljittämisessä

Uusi tARC-seq-menetelmä parantaa tarkkuutta SARS-CoV-2-mutaatioiden jäljittämisessä

Äskettäin Nature Microbiology -lehdessä julkaistussa tutkimuksessa tutkijat kehittivät kohdistetun, tarkan ribonukleiinihapon (RNA) konsensussekvensointimenetelmän (tARC-seq) vaikean akuutin hengitystieoireyhtymän koronavirus 2:n (SARS-CoV-2) mutaatioiden esiintymistiheyden ja tyypin määrittämiseksi tarkasti soluviljelmässä ja kliinisissä näytteissä.

tausta

SARS-CoV-2 replikoituu RNA-riippuvaisten RNA-polymeraasien (RdRp) kautta, jotka ovat virhealttiita. Replikointivirheiden seuranta on ratkaisevan tärkeää viruksen evoluution ymmärtämiseksi. Nykyiset lähestymistavat eivät kuitenkaan riitä tunnistamaan harvinaisia ​​de novo ribonukleiinihappomuutoksia.

Koronavirustauti 2019 (COVID-19) -pandemian aikana SARS-CoV-2-mutaatioiden määrä vaihteli välillä 10–6–10–4 emästä kohden solua kohti. Eksonukleaasin oikolukemisaktiivisuus lisää mutaatioiden määrää, mikä johtaa keskimäärin kahteen mutaatioon kussakin genomissa kuukaudessa.

Tietoja tutkimuksesta

Tässä tutkimuksessa tutkijat loivat tARC-seq:n tutkimaan SARS-CoV-2:n eroon vaikuttavien replikaatiovirheiden mekanismeja.

tARC-seq-lähestymistapa yhdistää ARC-seq-ominaisuudet hybridihankintateknologiaan parantaakseen kohteita ja mahdollistaakseen näiden näytteiden yksityiskohtaisen muunnelman kyselyn.

Tutkijat käyttivät tARC-seq:iä RNA-muunnelmien havaitsemiseen alkuperäisessä SARS-CoV-2-villityypin (WT) -kannassa, SARS-CoV-2-alfa- ja Omicron-varianteissa sekä kliinisissä ja Omicron-näytteissä.

Tutkijat sekvensoivat SARS-CoV-2:n villityypin RNA:n 4,0 infektiosyklin jälkeen ja tuottivat 9,0 × 105 plakkia muodostavaa yksikköä (pf.u.) SARS-CoV-2 RNA:ta. He lisäsivätE. coliMessenger RNA (mRNA) entsyymien kantajana kirjastojen tuotannossa. Hybridikaappaus havaitsi geenikirjastossa E. colin RNA:ta, jonka tutkijat tutkivat yksitellen ja käyttivät sisäisinä kontrolleina.

tARC-sekvensointitietojen valintojen tutkimiseksi edelleen tutkijat kartoittivat nonsense-tyyppisten, synonyymien ja ei-synonyymien varianttien taajuudet, jotka tunnistettiin tARC-sekvensoinnilla monostrukturaalisessa proteiinissa 12 (nsp12), tärkeässä geenissä, joka koodaa SARS-CoV-2 RdRp:tä.

He määrittelivät SARS-CoV-2 Spikessa (S) ja nsp12:ssa löydettyjen nonsense-tyyppisten ja ei-synonyymien yhden nukleotidin polymorfismien (SNP) evoluutiotoiminnan (EA) pisteet ja variaatiotaajuudet. He myös laskivat villityypin viruksen avoimien lukukehysten (ORF) keskimääräisen mutaatiotaajuuden mutaatiotyypin ja emäsmuutosten mukaan eriteltynä.

Tutkijat tutkivat RNA-varianttien satunnaista jakautumista SARS-CoV-2-genomissa käyttämällä sijaintiin perustuvaa arviointia ja nukleotidien identiteettianalyysiä. He käyttivät myös tARC-seq:iä kahdessa kliinisessä näytteessä spontaanien infektioiden aiheuttamien de novo -mutaatioiden etsimiseen.

He määrittelivät kymmenen yleisintä C>TT- ja G>AA-mutaatiota tunnetuille A3A-muokkauspaikoille villityypin viruksessa. Tutkijat tutkivat kaikkia SID-esiintymiä ≥ 2 nukleotidin komplementaarisella luovuttaja- ja vastaanottajakohtien välillä alavirtaan WT:ssä, Alphassa ja Omicronissa. He tutkivat TC>TT-mutaatioiden genomin laajuista esiintyvyyttä WT Vero -soluissa.

Tulokset

Tutkijat löysivät SARS-CoV-2-viruksesta 2,7 × 10-5 (keskiarvo) de novo -virhettä sykliä kohden, ja C>T-poikkeamat eivät johdu ensisijaisesti mRNA:ta muokkaavan entsyymin apolipoproteiini B -katalyyttisen polypeptidin (APOBEC) muokkaamisesta.

He tunnistivat viileitä ja kuumia alueita genomissa alhaisesta tai korkeasta GC-pitoisuudesta riippuen, mikä korosti transkription säätelyalueita virheille alttiimpina kohteina. tARC-seq-lähestymistapa mahdollistaa mallimuutosten, kuten poistojen, lisäysten ja monimutkaisten muutosten, havaitsemisen.

WT-viruksella on 1,1 × 10-4 RNA-variaatiota emästä kohti, ja emässubstituutiot muodostavat suurimman osan (8,4 × 10-5), joita seuraavat insertiot (2,5 × 10-6) ja deleetiot (2,1 × 10-5). G > A ja C > T -siirtymät hallitsevat viruksen mutaatiomaisemaa, ja niiden osuus kaikista esiintymisistä on 9,0 % ja 44 %.

Villityypin SARS-CoV-2:n ulkopuolisten lukujen mutaatiospektri ja -taajuus eroavat E. colin vastaavista, mikä osoittaa, että nämä mutaatiotapahtumat ovat todellisia virusmuutoksia eivätkä kirjaston valmistelun artefakteja.

Kaikkien kolmen nsp12-mutaatiotyypin satunnaisjakaumat ja vertailukelpoiset nopeudet viittaavat siihen, että useimmat tARC-sekvensoinnilla löydetyt RNA-variaatiot olivat de novo -tyyppisiä replikaatiovirheitä. Tutkijat eivät löytäneet eroja muunnelmien taajuuksissa SNP:iden välillä, joilla on alhaiset evolutionaariset toiminta-arvot (arvioidut neutraalit vaikutukset) ja niiden välillä, joilla on korkeat EA-arvot (arvioidut haitalliset vaikutukset) perussubstituutioalueella, mikä viittaa siihen, että valinnalla on vain rajallinen vaikutus.

Varianttinopeudet vaihtelevat merkittävästi paikkojen välillä, ja 643 lokusta osoittavat merkittävästi korkeammat emässubstituutiotaajuudet WT-viruksen kaksoiskappaleissa ja 80 toistuvat molemmissa WT-replikaateissa.

Tutkijat eivät löytäneet päällekkäisyyttä tARC-sekvensoinnin korkeimpien C>TT-hotspottien ja villityypin viruksen A3A-muokkausalueiden välillä. tARC-sekvensoinnin C>TT-taajuudet A3A-muokkausalueilla olivat yhdestä kahteen suuruusluokkaa pienempiä kuin korkeimman taajuuden tARC-sekvensoinnin C>TT-hotspotit.

Tutkimuksessa korostettiin tARC-seq:ää, erikoistunutta sekvensointimenetelmää, jolla tutkitaan replikaatiovirheitä, jotka vaikuttavat SARS-CoV-2:n eroihin. Tämä lähestymistapa lukee selektiivisesti spesifisiä RNA-molekyylejä konsensussekvenssin luomiseksi, jolloin tutkijat voivat havaita ja arvioida pieniä eroja ja virheitä viruksen replikaation aikana.

Se voi myös havaita de novo -insertiot ja -deleetiot SARS-CoV-2:ssa, jotka johtuvat soluviljelmäinfektiosta, mikä vahvistaa maailmanlaajuisen pandemian sekvensoinnin tulokset.

Tutkimuksessa havaittiin myös, että SARS-CoV-2:lla on eksonukleaasi-oikolukuominaisuudet, jotka voivat auttaa ymmärtämään ExoN:n ratkaisevan toiminnan.

Lähteet: