La méthode neuve tARC-seq améliore la précision dans le suivi des mutations du SRAS-CoV-2

La méthode neuve tARC-seq améliore la précision dans le suivi des mutations du SRAS-CoV-2

Dans une étude récente publiée dans Nature Microbiology, les chercheurs ont développé une approche ciblée et précise de séquençage consensuel de l'acide ribonucléique (ARN) (tARC-seq) pour déterminer avec précision les fréquences et les types de mutation du coronavirus 2 du syndrome respiratoire aigu sévère (SRAS-CoV-2) dans la culture cellulaire et les échantillons cliniques.

arrière-plan

Le SRAS-CoV-2 se réplique via les ARN polymérases ARN-dépendantes (RdRp), qui sont sujettes aux erreurs. La surveillance des erreurs de réplication est essentielle pour comprendre l’évolution des virus. Cependant, les approches existantes ne suffisent pas à identifier de rares altérations de novo de l’acide ribonucléique.

Pendant la pandémie de la maladie à coronavirus 2019 (COVID-19), les taux de mutation du SRAS-CoV-2 variaient de 10−6 à 10−4 par base et par cellule. L’activité de relecture des exonucléases augmente les taux de mutation, ce qui entraîne une moyenne de deux mutations dans chaque génome par mois.

À propos de l'étude

Dans la présente étude, les chercheurs ont créé le tARC-seq pour étudier les mécanismes des erreurs de réplication affectant la divergence du SRAS-CoV-2.

L'approche tARC-seq combine les fonctionnalités ARC-seq avec une technologie d'acquisition hybride pour améliorer les cibles et permettre une interrogation détaillée des variantes de ces échantillons.

Les chercheurs ont utilisé tARC-seq pour détecter les variations d’ARN dans la souche originale du type sauvage (WT) du SRAS-CoV-2, les variantes du SRAS-CoV-2 alpha et Omicron, ainsi que dans les échantillons cliniques et Omicron.

Les chercheurs ont séquencé l’ARN de type sauvage du SRAS-CoV-2 après 4,0 cycles d’infection et ont généré 9,0 × 105 unités formant plaque (pf.u.) d’ARN du SRAS-CoV-2. Ils ont ajoutéE. coliARN messager (ARNm) comme support d'enzymes pour la production de bibliothèques. La capture hybride a détecté l'ARN d'E. coli dans la bibliothèque de gènes, que les chercheurs ont examiné individuellement et utilisé comme contrôles internes.

Pour étudier plus en détail les sélections dans les données de séquençage tARC, les chercheurs ont cartographié les fréquences des variantes de type non-sens, synonymes et non synonymes identifiées par le séquençage tARC dans la protéine monostructurale 12 (nsp12), un gène critique codant pour le SARS-CoV-2 RdRp.

Ils ont déterminé les scores d’action évolutive (EA) et les fréquences de variation pour les polymorphismes mononucléotidiques (SNP) de type non-sens et non synonymes trouvés dans SARS-CoV-2 Spike (S) et nsp12. Ils ont également calculé la fréquence moyenne de mutation des cadres de lecture ouverts (ORF) dans le virus de type sauvage, décomposée par type de mutation et changements de base.

Les chercheurs ont examiné la distribution aléatoire des variantes d’ARN dans le génome du SRAS-CoV-2 à l’aide d’une estimation basée sur la localisation et d’une analyse d’identité des nucléotides. Ils ont également utilisé tARC-seq sur deux échantillons cliniques pour rechercher des mutations de novo provoquées par des infections spontanées.

Ils ont attribué les dix mutations C>TT et G>AA les plus courantes aux sites d’édition A3A connus du virus de type sauvage. Les chercheurs ont examiné toutes les occurrences de SID avec ≥2 nucléotides de complémentarité entre les sites donneurs et accepteurs en aval dans WT, Alpha et Omicron. Ils ont examiné la prévalence à l’échelle du génome des mutations TC>TT dans les cellules WT Vero.

Résultats

Les chercheurs ont trouvé 2,7 × 10−5 (moyenne) erreurs de novo par cycle dans le virus SARS-CoV-2, avec des biais C>T qui ne sont pas principalement dus à l’édition du polypeptide catalytique de l’enzyme d’édition de l’ARNm, l’apolipoprotéine B (APOBEC).

Ils ont identifié des régions froides et chaudes à travers le génome en fonction de la concentration faible ou élevée de GC, mettant en évidence les régions régulatrices transcriptionnelles comme des sites plus sujets aux erreurs. L'approche tARC-seq permet de détecter les modifications de modèle telles que les suppressions, les insertions et les modifications compliquées.

Le virus WT présente 1,1 × 10-4 variations d'ARN par base, les substitutions de bases représentant la majorité (8,4 × 10-5), suivies des insertions (2,5 × 10-6) et des délétions (2,1 × 10-5). Les transitions G > A et C > T dominent le paysage des mutations virales, représentant respectivement 9,0 % et 44 % de toutes les occurrences.

Le spectre de mutation et la fréquence des lectures hors cible du SARS-CoV-2 de type sauvage sont différents de ceux d'E. coli, démontrant que ces événements de mutation sont de véritables changements viraux et non des artefacts de la préparation de la bibliothèque.

Des distributions aléatoires et des taux comparables des trois types de mutations nsp12 suggèrent que la plupart des variations d'ARN trouvées par le séquençage tARC étaient des erreurs de réplication de type de novo. Les chercheurs n'ont trouvé aucune différence dans les fréquences variantes entre les SNP avec de faibles valeurs d'action évolutive (effets neutres estimés) et ceux avec des valeurs EA élevées (effets délétères estimés) sur toute la plage de substitution de base, ce qui suggère que la sélection n'a qu'une influence limitée.

Les taux de variantes varient considérablement d’un site à l’autre, avec 643 loci présentant des fréquences de substitution de bases significativement plus élevées dans les doublons du virus WT et 80 récurrents dans les deux réplications du virus WT.

Les chercheurs n’ont trouvé aucun chevauchement entre les points chauds C>TT de fréquence la plus élevée issus du séquençage tARC et les régions d’édition A3A du virus de type sauvage. Les fréquences C>TT de séquençage tARC dans les régions d’édition A3A étaient inférieures d’un à deux ordres de grandeur aux points chauds C>TT de séquençage tARC à la fréquence la plus élevée.

L'étude a mis en valeur le tARC-seq, une approche de séquençage spécialisée pour étudier les erreurs de réplication qui influencent la divergence du SRAS-CoV-2. Cette approche lit sélectivement des molécules d'ARN spécifiques pour générer une séquence consensus, permettant aux chercheurs de détecter et d'évaluer des différences et des erreurs mineures lors de la réplication du virus.

Il peut également détecter des insertions et des délétions de novo dans le SRAS-CoV-2 résultant d’une infection par culture cellulaire, confirmant ainsi les résultats du séquençage de la pandémie mondiale.

L’étude a également révélé que le SRAS-CoV-2 possède des capacités de relecture des exonucléases, ce qui peut aider à comprendre la fonction cruciale d’ExoN.

Sources :