Az új tARC-seq módszer javítja a SARS-CoV-2 mutációk nyomon követésének pontosságát

Az új tARC-seq módszer javítja a SARS-CoV-2 mutációk nyomon követésének pontosságát

A Nature Microbiology folyóiratban nemrég megjelent tanulmányban a kutatók célzott, pontos ribonukleinsav (RNS) konszenzus szekvenálási (tARC-seq) megközelítést dolgoztak ki a súlyos akut légúti szindróma koronavírus 2 (SARS-CoV-2) mutációi gyakoriságának és típusainak pontos meghatározására sejttenyészetekben és klinikai mintákban.

háttér

A SARS-CoV-2 RNS-függő RNS-polimerázokon (RdRp) keresztül replikálódik, amelyek hibára hajlamosak. A replikációs hibák figyelése elengedhetetlen a vírus evolúciójának megértéséhez. A meglévő megközelítések azonban nem elegendőek a ritka de novo ribonukleinsav-elváltozások azonosításához.

A 2019-es koronavírus-betegség (COVID-19) világjárvány idején a SARS-CoV-2 mutációs rátája bázisonként sejtenként 10–6 és 10–4 között mozgott. Az exonukleáz lektorálási aktivitás növeli a mutációs rátát, ami átlagosan két mutációt eredményez minden genomban havonta.

A tanulmányról

A jelen tanulmányban a kutatók létrehozták a tARC-seq-et, hogy megvizsgálják a SARS-CoV-2 eltérését befolyásoló replikációs hibák mechanizmusait.

A tARC-seq megközelítés ötvözi az ARC-seq jellemzőit a hibrid adatgyűjtési technológiával, hogy javítsa a célpontokat, és lehetővé tegye ezeknek a mintáknak a változatos lekérdezését.

A kutatók a tARC-seq segítségével kimutatták az RNS-variációkat az eredeti SARS-CoV-2 vad típusú (WT) törzsben, a SARS-CoV-2 alfa és Omicron változatokban, valamint klinikai és Omicron mintákban.

A kutatók 4,0 fertőzési ciklus után szekvenálták a SARS-CoV-2 vad típusú RNS-t, és 9,0 × 105 plakkképző egység (pf.u.) SARS-CoV-2 RNS-t hoztak létre. HozzátettékE. coliMessenger RNS (mRNS) mint enzimhordozó a könyvtárak előállításához. A hibrid befogás E. coli RNS-t mutatott ki a génkönyvtárban, amelyet a kutatók egyenként megvizsgáltak és belső kontrollként használtak.

A tARC szekvenálási adatok szelekcióinak további vizsgálata érdekében a kutatók feltérképezték a tARC szekvenálással azonosított nonszensz típusú, szinonim és nem szinonim variánsok gyakoriságát a 12-es monostrukturális fehérjében (nsp12), egy SARS-CoV-2 RdRp-t kódoló kritikus génben.

Meghatározták a SARS-CoV-2 Spike-ben (S) és nsp12-ben található nonszensz típusú és nem szinonim egynukleotidos polimorfizmusok (SNP) evolúciós cselekvési (EA) pontszámait és variációs gyakoriságait. Kiszámolták a vad típusú vírus nyílt leolvasási kereteinek (ORF-ek) átlagos mutációs gyakoriságát is, mutációtípusra és bázisváltozásokra lebontva.

A kutatók a SARS-CoV-2 genomban az RNS-variánsok véletlenszerű eloszlását vizsgálták helyalapú becslés és nukleotid-azonosság-elemzés segítségével. Két klinikai mintán is alkalmazták a tARC-seq-et a spontán fertőzések által okozott de novo mutációk keresésére.

A tíz leggyakoribb C>TT és G>AA mutációt a vad típusú vírus ismert A3A szerkesztőhelyeihez rendelték. A kutatók megvizsgálták az összes SID előfordulást ≥2 nukleotid komplementaritás mellett a donor és akceptor helyek között a WT-ben, az Alpha-ban és az Omicronban. Megvizsgálták a TC>TT mutációk genomszintű prevalenciáját WT Vero sejtekben.

Eredmények

A kutatók ciklusonként 2,7 × 10-5 (átlagos) de novo hibát találtak a SARS-CoV-2 vírusban, a C>T torzításokkal nem elsősorban az apolipoprotein B katalitikus polipeptid (APOBEC) mRNS-szerkesztő enzim szerkesztése miatt.

Az alacsony vagy magas GC-koncentrációtól függően hideg és meleg régiókat azonosítottak a genomban, kiemelve a transzkripciós szabályozó régiókat, mint a hibákra hajlamosabb helyeket. A tARC-seq megközelítés lehetővé teszi a sablonváltozások, például törlések, beillesztések és bonyolult változtatások észlelését.

A WT-vírus bázisonként 1,1 × 10-4 RNS-variációt tartalmaz, a legtöbbet a bázisszubsztitúciók teszik ki (8,4 × 10-5), ezt követik az inszerciók (2,5 × 10-6) és a deléciók (2,1 × 10-5). A G > A és C > T átmenetek uralják a vírusmutációs tájat, az összes előfordulás 9,0%-át, illetve 44%-át teszik ki.

A vad típusú SARS-CoV-2 off-target leolvasások mutációs spektruma és gyakorisága eltér az E. coliétól, ami azt mutatja, hogy ezek a mutációs események valódi vírusváltozások, és nem a könyvtár előkészítésének műtermékei.

Mindhárom nsp12 mutációtípus véletlenszerű eloszlása ​​és összehasonlítható aránya arra utal, hogy a tARC szekvenálással talált RNS-variációk többsége de novo típusú replikációs hiba volt. A kutatók nem találtak különbséget a variánsok gyakoriságában az alacsony evolúciós hatásértékkel rendelkező SNP-k (becsült semleges hatások) és a magas EA-értékekkel (becsült káros hatások) SNP-k között az alaphelyettesítési tartományban, ami arra utal, hogy a szelekciónak csak korlátozott hatása van.

A variációs arányok jelentősen eltérnek az egyes helyek között, 643 lókusz szignifikánsan magasabb bázisszubsztitúciós gyakoriságot mutat a WT vírus ismétlődésében, és 80 ismétlődő mindkét WT replikátumban.

A kutatók nem találtak átfedést a tARC szekvenálásból származó legmagasabb frekvenciájú C>TT hotspotok és a vad típusú vírus A3A szerkesztő régiói között. A tARC szekvenáló C>TT frekvenciák az A3A szerkesztési régiókban egy-két nagyságrenddel alacsonyabbak voltak, mint a legmagasabb frekvenciájú tARC szekvenáló C>TT hotspotok.

A tanulmány kiemelte a tARC-seq-et, egy speciális szekvenálási megközelítést a SARS-CoV-2 eltérését befolyásoló replikációs hibák vizsgálatára. Ez a megközelítés szelektíven olvas bizonyos RNS-molekulákat, hogy konszenzusos szekvenciát hozzon létre, lehetővé téve a kutatóknak, hogy észleljék és értékeljék a vírusreplikáció során előforduló kisebb eltéréseket és hibákat.

A SARS-CoV-2 sejttenyészet fertőzéséből származó de novo inszerciókat és deléciókat is képes kimutatni, megerősítve a globális pandémiás szekvenálás eredményeit.

A tanulmány azt is megállapította, hogy a SARS-CoV-2 exonukleáz-lektori képességekkel rendelkezik, ami segíthet megérteni az ExoN kulcsfontosságú funkcióját.

Források: