Il nuovo metodo tARC-seq migliora la precisione nel tracciamento delle mutazioni SARS-CoV-2

Il nuovo metodo tARC-seq migliora la precisione nel tracciamento delle mutazioni SARS-CoV-2

In un recente studio pubblicato su Nature Microbiology, i ricercatori hanno sviluppato un approccio mirato e accurato di sequenziamento consensuale dell’acido ribonucleico (RNA) (tARC-seq) per determinare con precisione le frequenze e i tipi di mutazione della sindrome respiratoria acuta grave del coronavirus 2 (SARS-CoV-2) nelle colture cellulari e nei campioni clinici.

sfondo

SARS-CoV-2 si replica tramite RNA polimerasi RNA-dipendenti (RdRp), che sono soggette a errori. Il monitoraggio degli errori di replica è fondamentale per comprendere l’evoluzione dei virus. Tuttavia, gli approcci esistenti non sono sufficienti per identificare rare alterazioni dell’acido ribonucleico de novo.

Durante la pandemia della malattia da coronavirus 2019 (COVID-19), i tassi di mutazione SARS-CoV-2 variavano da 10−6 a 10−4 per base per cellula. L’attività di correzione delle bozze dell’esonucleasi aumenta i tassi di mutazione, risultando in una media di due mutazioni in ciascun genoma al mese.

A proposito dello studio

Nel presente studio, i ricercatori hanno creato tARC-seq per studiare i meccanismi degli errori di replica che influenzano la divergenza SARS-CoV-2.

L'approccio tARC-seq combina le funzionalità ARC-seq con la tecnologia di acquisizione ibrida per migliorare i target e consentire l'interrogazione dettagliata delle varianti di questi campioni.

I ricercatori hanno utilizzato tARC-seq per rilevare le variazioni dell’RNA nel ceppo originale di SARS-CoV-2 wild-type (WT), nelle varianti SARS-CoV-2 alfa e Omicron e nei campioni clinici e Omicron.

I ricercatori hanno sequenziato l’RNA wild-type del SARS-CoV-2 dopo 4,0 cicli di infezione e hanno generato 9,0 × 105 unità formanti placca (pf.u.) SARS-CoV-2 RNA. Hanno aggiuntoEscherichia coliRNA messaggero (mRNA) come trasportatore di enzimi per la produzione di librerie. La cattura ibrida ha rilevato l'RNA di E. coli nella libreria genetica, che i ricercatori hanno esaminato individualmente e utilizzato come controlli interni.

Per studiare ulteriormente le selezioni nei dati di sequenziamento tARC, i ricercatori hanno mappato le frequenze delle varianti di tipo senza senso, sinonimi e non sinonimi identificate dal sequenziamento tARC nella proteina monostrutturale 12 (nsp12), un gene critico che codifica SARS-CoV-2 RdRp.

Hanno determinato i punteggi di azione evolutiva (EA) e le frequenze di variazione per i polimorfismi a singolo nucleotide (SNP) di tipo senza senso e non sinonimi trovati in SARS-CoV-2 Spike (S) e nsp12. Hanno inoltre calcolato la frequenza media di mutazione degli open reading frames (ORF) nel virus wild-type, suddivisa per tipo di mutazione e cambiamenti di base.

I ricercatori hanno esaminato la distribuzione casuale delle varianti di RNA nel genoma SARS-CoV-2 utilizzando la stima basata sulla posizione e l’analisi dell’identità nucleotidica. Hanno anche utilizzato tARC-seq su due campioni clinici per cercare mutazioni de novo causate da infezioni spontanee.

Hanno assegnato le dieci mutazioni C>TT e G>AA più comuni ai siti di editing A3A noti nel virus wild-type. I ricercatori hanno esaminato tutte le occorrenze di SID con ≥2 nucleotidi di complementarità tra i siti donatori e accettori a valle in WT, Alpha e Omicron. Hanno esaminato la prevalenza a livello genomico delle mutazioni TC>TT nelle cellule WT Vero.

Risultati

I ricercatori hanno trovato 2,7 × 10−5 errori de novo (medi) per ciclo nel virus SARS-CoV-2, con bias C>T non dovuti principalmente alla modifica del polipeptide catalitico dell’apolipoproteina B (APOBEC) che modifica l’mRNA.

Hanno identificato regioni fredde e calde nel genoma a seconda della concentrazione bassa o alta di GC, evidenziando le regioni regolatrici della trascrizione come siti più inclini agli errori. L'approccio tARC-seq consente il rilevamento di modifiche al modello come eliminazioni, inserimenti e modifiche complicate.

Il virus WT presenta 1,1 × 10-4 variazioni di RNA per base, con sostituzioni di basi che rappresentano la maggioranza (8,4 × 10-5), seguite da inserimenti (2,5 × 10-6) ed eliminazioni (2,1 × 10-5). Le transizioni G > A e C > T dominano il panorama delle mutazioni virali, rappresentando rispettivamente il 9,0% e il 44% di tutti gli eventi.

Lo spettro delle mutazioni e la frequenza delle letture fuori bersaglio del SARS-CoV-2 wild-type sono diversi da quelli di E. coli, dimostrando che questi eventi di mutazione sono veri cambiamenti virali e non artefatti della preparazione della libreria.

Distribuzioni casuali e tassi comparabili di tutti e tre i tipi di mutazione nsp12 suggeriscono che la maggior parte delle variazioni di RNA trovate dal sequenziamento tARC erano errori di replicazione di tipo de novo. I ricercatori non hanno trovato differenze nelle frequenze delle varianti tra gli SNP con bassi valori di azione evolutiva (effetti neutri stimati) e quelli con valori EA elevati (effetti deleteri stimati) nell’intervallo di sostituzione delle basi, suggerendo che la selezione ha solo un’influenza limitata.

I tassi di varianti variano in modo significativo tra i siti, con 643 loci che mostrano frequenze di sostituzione di basi significativamente più elevate nei duplicati del virus WT e 80 ricorrenti in entrambe le repliche WT.

I ricercatori non hanno trovato alcuna sovrapposizione tra gli hotspot C>TT con la frequenza più alta dal sequenziamento tARC e le regioni modificanti A3A nel virus wild-type. Le frequenze C>TT del sequenziamento tARC nelle regioni di editing A3A erano da uno a due ordini di grandezza inferiori rispetto agli hotspot C>TT del sequenziamento tARC con la frequenza più alta.

Lo studio ha evidenziato tARC-seq, un approccio d’ordinamento specializzato per studiare gli errori di replica che influenzano la divergenza SARS-CoV-2. Questo approccio legge selettivamente alcune molecole di RNA per generare una sequenza consenso, consentendo ai ricercatori di rilevare e valutare piccole differenze ed errori durante la replicazione del virus.

Può anche rilevare inserzioni ed eliminazioni de novo nella SARS-CoV-2 risultanti dall’infezione di colture cellulari, confermando i risultati del sequenziamento pandemico globale.

Lo studio ha anche scoperto che SARS-CoV-2 ha capacità di correzione di bozze di esonucleasi, che possono aiutare a comprendere la funzione cruciale di ExoN.

Fonti: