Naujasis tARC-seq metodas pagerina SARS-CoV-2 mutacijų sekimo tikslumą

Naujasis tARC-seq metodas pagerina SARS-CoV-2 mutacijų sekimo tikslumą

Neseniai „Nature Microbiology“ paskelbtame tyrime mokslininkai sukūrė tikslinį, tikslų ribonukleino rūgšties (RNR) konsensuso sekos (tARC-seq) metodą, skirtą tiksliai nustatyti sunkaus ūminio kvėpavimo sindromo koronaviruso 2 (SARS-CoV-2) mutacijų dažnį ir tipus ląstelių kultūroje ir klinikiniuose mėginiuose.

fone

SARS-CoV-2 replikuojasi per nuo RNR priklausomas RNR polimerazes (RdRp), kurios yra linkusios į klaidas. Replikacijos klaidų stebėjimas yra labai svarbus norint suprasti viruso evoliuciją. Tačiau esamų metodų nepakanka retiems de novo ribonukleino rūgšties pakitimams nustatyti.

2019 m. koronavirusinės ligos (COVID-19) pandemijos metu SARS-CoV-2 mutacijų dažnis svyravo nuo 10–6 iki 10–4 vienai bazei vienoje ląstelėje. Egzonukleazės korektūros aktyvumas padidina mutacijų dažnį, todėl kiekviename genome per mėnesį įvyksta vidutiniškai dvi mutacijos.

Apie studiją

Šiame tyrime mokslininkai sukūrė tARC-seq, kad ištirtų replikacijos klaidų, turinčių įtakos SARS-CoV-2 skirtumui, mechanizmus.

tARC-seq metodas sujungia ARC-seq funkcijas su hibridine gavimo technologija, kad pagerintų taikinius ir įgalintų išsamų šių pavyzdžių apklausą.

Tyrėjai naudojo tARC-seq, kad nustatytų RNR variacijas originalioje SARS-CoV-2 laukinio tipo (WT) padermėje, SARS-CoV-2 alfa ir Omicron variantuose bei klinikiniuose ir Omicron mėginiuose.

Tyrėjai sekvenavo SARS-CoV-2 laukinio tipo RNR po 4,0 infekcijos ciklų ir sukūrė 9,0 × 105 apnašas formuojančius vienetus (pf.u.) SARS-CoV-2 RNR. Jie pridūrėE. coliMessenger RNR (mRNR) kaip fermento nešiklis bibliotekoms gaminti. Hibridinis gaudymas aptiko E. coli RNR genų bibliotekoje, kurią mokslininkai ištyrė individualiai ir naudojo kaip vidinę kontrolę.

Norėdami toliau tirti tARC sekos nustatymo duomenų atrankas, mokslininkai sudarė nesąmoningų, sinoniminių ir nesinoniminių variantų, nustatytų tARC sekos nustatymu, dažnius monostruktūriniame baltyme 12 (nsp12), kritiniame gene, koduojančiame SARS-CoV-2 RdRp.

Jie nustatė evoliucinio veiksmo (EA) balus ir variacijos dažnius beprasmiško tipo ir nesinoniminiams vieno nukleotido polimorfizmams (SNP), aptiktiems SARS-CoV-2 Spike (S) ir nsp12. Jie taip pat apskaičiavo vidutinį atvirų skaitymo rėmelių (ORF) mutacijų dažnį laukinio tipo viruse, suskirstytą pagal mutacijos tipą ir bazinius pokyčius.

Tyrėjai ištyrė atsitiktinį RNR variantų pasiskirstymą SARS-CoV-2 genome, naudodami vietos įvertinimą ir nukleotidų tapatybės analizę. Jie taip pat naudojo tARC-seq dviejuose klinikiniuose mėginiuose, norėdami ieškoti de novo mutacijų, kurias sukėlė spontaniškos infekcijos.

Jie priskyrė dešimt dažniausiai pasitaikančių C>TT ir G>AA mutacijų žinomoms A3A redagavimo vietoms laukinio tipo viruse. Tyrėjai ištyrė visus SID atvejus su ≥2 nukleotidų komplementarumu tarp donoro ir akceptoriaus vietų pasroviui WT, Alpha ir Omicron. Jie ištyrė TC> TT mutacijų paplitimą visame genome WT Vero ląstelėse.

Rezultatai

Tyrėjai nustatė 2,7 × 10–5 (vidutiniškai) de novo klaidų per ciklą SARS-CoV-2 viruse, o C>T paklaidos pirmiausia nebuvo susijusios su mRNR redagavimo fermento apolipoproteino B katalizinio polipeptido (APOBEC) redagavimu.

Jie nustatė vėsius ir karštus regionus visame genome, priklausomai nuo mažos ar didelės GC koncentracijos, pabrėždami transkripcijos reguliavimo sritis kaip vietas, kuriose yra daugiau klaidų. tARC-seq metodas leidžia aptikti šablono pakeitimus, tokius kaip ištrynimai, įterpimai ir sudėtingi pakeitimai.

WT virusas turi 1,1 × 10–4 RNR variacijų vienai bazei, o bazių pakaitalai sudaro didžiąją dalį (8,4 × 10–5), po kurių seka intarpai (2,5 × 10–6) ir delecijos (2,1 × 10–5). Virusų mutacijų kraštovaizdyje dominuoja G > A ir C > T perėjimai, atitinkamai sudaro 9,0 % ir 44 % visų atvejų.

Laukinio tipo SARS-CoV-2 netikslinių nuskaitymų mutacijų spektras ir dažnis skiriasi nuo E. coli, o tai rodo, kad šie mutacijų įvykiai yra tikri virusiniai pokyčiai, o ne bibliotekos paruošimo artefaktai.

Atsitiktinis visų trijų nsp12 mutacijų tipų pasiskirstymas ir palyginami rodikliai rodo, kad dauguma RNR variacijų, nustatytų tARC sekos nustatymo būdu, buvo de novo tipo replikacijos klaidos. Tyrėjai nenustatė variantų dažnių skirtumų tarp SNP su mažomis evoliucinio veikimo vertėmis (numatomas neutralus poveikis) ir tų, kurių EA vertės yra didelės (numatomas žalingas poveikis) baziniame pakeitimo diapazone, o tai rodo, kad atranka turi tik ribotą įtaką.

Variantų dažnis įvairiose vietose labai skiriasi: 643 lokusai rodo žymiai didesnį bazinių pakeitimų dažnį WT viruso kopijose ir 80 pasikartoja abiejuose WT pakartojimuose.

Tyrėjai nerado sutapimo tarp didžiausio dažnio C>TT taškai iš tARC sekos ir A3A redagavimo regionų laukinio tipo viruse. tARC sekos C>TT dažniai A3A redagavimo regionuose buvo viena ar dviem dydžiais mažesni nei aukščiausio dažnio tARC sekos C>TT taškai.

Tyrimas pabrėžė tARC-seq, specializuotą sekos nustatymo metodą, skirtą tirti replikacijos klaidas, turinčias įtakos SARS-CoV-2 skirtumui. Šis metodas selektyviai nuskaito tam tikras RNR molekules, kad sukurtų konsensuso seką, leidžiančią tyrėjams aptikti ir įvertinti nedidelius skirtumus ir klaidas viruso replikacijos metu.

Jis taip pat gali aptikti SARS-CoV-2 de novo įterpimus ir ištrynimus, atsiradusius dėl ląstelių kultūros infekcijos, patvirtinant pasaulinės pandemijos sekos rezultatus.

Tyrimas taip pat parodė, kad SARS-CoV-2 turi egzonukleazės korektūros galimybes, kurios gali padėti suprasti esminę ExoN funkciją.

Šaltiniai: