Jaunā tARC-seq metode uzlabo SARS-CoV-2 mutāciju izsekošanas precizitāti

Jaunā tARC-seq metode uzlabo SARS-CoV-2 mutāciju izsekošanas precizitāti

Nesenā pētījumā, kas publicēts Nature Microbiology, pētnieki izstrādāja mērķtiecīgu, precīzu ribonukleīnskābes (RNS) konsensa secības (tARC-seq) pieeju, lai precīzi noteiktu smaga akūta respiratorā sindroma koronavīrusa 2 (SARS-CoV-2) mutāciju biežumu un veidus šūnu kultūrā un klīniskajos paraugos.

fons

SARS-CoV-2 replikējas, izmantojot no RNS atkarīgās RNS polimerāzes (RdRp), kuras ir pakļautas kļūdām. Replikācijas kļūdu uzraudzība ir būtiska, lai izprastu vīrusa attīstību. Tomēr esošās pieejas nav pietiekamas, lai identificētu retas de novo ribonukleīnskābes izmaiņas.

2019. gada koronavīrusa slimības (COVID-19) pandēmijas laikā SARS-CoV-2 mutāciju biežums svārstījās no 10–6 līdz 10–4 uz bāzi vienā šūnā. Eksonukleāzes korektūras darbība palielina mutāciju ātrumu, kā rezultātā katrā genomā mēnesī notiek vidēji divas mutācijas.

Par pētījumu

Šajā pētījumā pētnieki izveidoja tARC-seq, lai izpētītu replikācijas kļūdu mehānismus, kas ietekmē SARS-CoV-2 atšķirības.

tARC-seq pieeja apvieno ARC-seq funkcijas ar hibrīda iegūšanas tehnoloģiju, lai uzlabotu mērķus un nodrošinātu šo paraugu detalizētu variantu nopratināšanu.

Pētnieki izmantoja tARC-seq, lai noteiktu RNS variācijas sākotnējā SARS-CoV-2 savvaļas tipa (WT) celmā, SARS-CoV-2 alfa un Omicron variantos, kā arī klīniskajos un Omicron paraugos.

Pētnieki sekvencēja SARS-CoV-2 savvaļas tipa RNS pēc 4,0 infekcijas cikliem un radīja 9,0 × 105 aplikumu veidojošas vienības (pf.u.) SARS-CoV-2 RNS. Viņi piebildaE. coliMessenger RNS (mRNS) kā enzīmu nesējs bibliotēku ražošanai. Hibrīda uztveršana atklāja E. coli RNS gēnu bibliotēkā, ko pētnieki pārbaudīja atsevišķi un izmantoja kā iekšējo kontroli.

Lai turpinātu pētīt tARC sekvencēšanas datu atlasi, pētnieki kartēja absurda tipa, sinonīmu un nesinonīmu variantu frekvences, kas identificētas ar tARC sekvencēšanu monostrukturālajā proteīnā 12 (nsp12), kas ir kritisks gēns, kas kodē SARS-CoV-2 RdRp.

Viņi noteica evolucionārās darbības (EA) rādītājus un variāciju biežumu bezjēdzīga tipa un nesinonīmiem viena nukleotīda polimorfismiem (SNP), kas konstatēti SARS-CoV-2 smaile (S) un nsp12. Viņi arī aprēķināja savvaļas tipa vīrusa atvērto lasīšanas rāmju (ORF) vidējo mutāciju biežumu, kas sadalīts pēc mutācijas veida un bāzes izmaiņām.

Pētnieki pārbaudīja RNS variantu nejaušo sadalījumu SARS-CoV-2 genomā, izmantojot uz atrašanās vietu balstītu novērtējumu un nukleotīdu identitātes analīzi. Viņi arī izmantoja tARC-seq diviem klīniskiem paraugiem, lai meklētu de novo mutācijas, ko izraisīja spontānas infekcijas.

Viņi piešķīra desmit visizplatītākās C>TT un G>AA mutācijas zināmajām A3A rediģēšanas vietām savvaļas tipa vīrusā. Pētnieki pārbaudīja visus SID gadījumus ar ≥ 2 komplementaritātes nukleotīdiem starp donoru un akceptoru vietām lejup pa straumi WT, Alpha un Omicron. Viņi pārbaudīja TC> TT mutāciju izplatību visā genomā WT Vero šūnās.

Rezultāti

Pētnieki konstatēja 2,7 × 10–5 (vidējās) de novo kļūdas vienā ciklā SARS-CoV-2 vīrusā, un C>T novirzes galvenokārt nav saistītas ar mRNS rediģēšanas enzīma apolipoproteīna B katalītiskā polipeptīda (APOBEC) rediģēšanu.

Viņi identificēja vēsus un karstus reģionus visā genomā atkarībā no zemas vai augstas GC koncentrācijas, izceļot transkripcijas regulējošos reģionus kā vietas, kas ir vairāk pakļautas kļūdām. tARC-seq pieeja ļauj noteikt veidņu izmaiņas, piemēram, dzēšanu, ievietošanu un sarežģītas izmaiņas.

WT vīrusam ir 1,1 × 10–4 RNS variācijas uz vienu bāzi, un lielāko daļu veido bāzes aizvietojumi (8,4 × 10–5), kam seko ievietošana (2,5 × 10–6) un dzēšana (2,1 × 10–5). G > A un C > T pārejas dominē vīrusu mutāciju ainavā, veidojot attiecīgi 9, 0% un 44% no visiem gadījumiem.

Savvaļas tipa SARS-CoV-2 ārpusmērķa nolasījumu mutāciju spektrs un biežums atšķiras no E. coli nolasīšanas, pierādot, ka šie mutāciju notikumi ir patiesas vīrusu izmaiņas, nevis bibliotēkas sagatavošanas artefakti.

Visu trīs nsp12 mutāciju veidu nejaušie sadalījumi un salīdzināmie ātrumi liecina, ka lielākā daļa RNS variāciju, kas atrastas ar tARC sekvencēšanu, bija de novo tipa replikācijas kļūdas. Pētnieki nekonstatēja atšķirības variantu frekvencēs starp SNP ar zemām evolūcijas darbības vērtībām (paredzamie neitrālie efekti) un tiem, kuriem ir augstas EA vērtības (aplēstā kaitīgā ietekme) visā bāzes aizstāšanas diapazonā, kas liecina, ka atlasei ir tikai ierobežota ietekme.

Variantu biežums dažādās vietās ievērojami atšķiras, 643 lokusos uzrāda ievērojami augstāku bāzes aizstāšanas biežumu WT vīrusa dublikātos un 80 atkārtojumus abos WT atkārtojumos.

Pētnieki neatrada pārklāšanos starp augstākās frekvences C>TT karstajiem punktiem no tARC sekvencēšanas un A3A rediģēšanas reģioniem savvaļas tipa vīrusā. tARC sekvencēšanas C>TT frekvences A3A rediģēšanas reģionos bija par vienu līdz divām kārtām zemākas nekā augstākās frekvences tARC sekvencēšanas C>TT karstajiem punktiem.

Pētījumā tika uzsvērta tARC-seq, specializēta secības noteikšanas pieeja, lai izpētītu replikācijas kļūdas, kas ietekmē SARS-CoV-2 atšķirības. Šī pieeja selektīvi nolasa specifiskas RNS molekulas, lai radītu konsensa secību, ļaujot pētniekiem atklāt un novērtēt nelielas atšķirības un kļūdas vīrusa replikācijas laikā.

Tas var arī noteikt de novo ievietošanu un dzēšanu SARS-CoV-2, kas radušās šūnu kultūras infekcijas rezultātā, apstiprinot globālās pandēmijas sekvencēšanas rezultātus.

Pētījumā arī konstatēts, ka SARS-CoV-2 ir eksonukleāzes korektūras iespējas, kas var palīdzēt izprast ExoN būtisko funkciju.

Avoti: