Noua metodă tARC-seq îmbunătățește precizia în urmărirea mutațiilor SARS-CoV-2

Noua metodă tARC-seq îmbunătățește precizia în urmărirea mutațiilor SARS-CoV-2

Într-un studiu recent publicat în Nature Microbiology, cercetătorii au dezvoltat o abordare țintită și precisă de secvențiere consensuală a acidului ribonucleic (ARN) (tARC-seq) pentru a determina cu exactitate frecvențele și tipurile de mutații ale sindromului respirator acut sever coronavirus 2 (SARS-CoV-2) în cultura celulară și probele clinice.

fundal

SARS-CoV-2 se replic prin ARN polimeraze dependente de ARN (RdRp), care sunt predispuse la erori. Monitorizarea erorilor de replicare este esențială pentru înțelegerea evoluției virusului. Cu toate acestea, abordările existente nu sunt suficiente pentru a identifica modificări rare ale acidului ribonucleic de novo.

În timpul pandemiei bolii coronavirus 2019 (COVID-19), ratele de mutație SARS-CoV-2 au variat între 10-6 și 10-4 pe bază per celulă. Activitatea de corectare a exonucleazei crește ratele de mutație, rezultând în medie două mutații în fiecare genom pe lună.

Despre studiu

În studiul de față, cercetătorii au creat tARC-seq pentru a investiga mecanismele erorilor de replicare care afectează divergența SARS-CoV-2.

Abordarea tARC-seq combină caracteristicile ARC-seq cu tehnologia de achiziție hibridă pentru a îmbunătăți țintele și a permite interogarea detaliată a variantelor acestor mostre.

Cercetătorii au folosit tARC-seq pentru a detecta variațiile ARN în tulpina originală SARS-CoV-2 de tip sălbatic (WT), variantele SARS-CoV-2 alfa și Omicron și probele clinice și Omicron.

Cercetătorii au secvențiat SARS-CoV-2 ARN de tip sălbatic după 4,0 cicluri de infecție și au generat 9,0 × 105 unități formatoare de plăci (pf.u.) SARS-CoV-2 ARN. Au adăugatE. coliARN mesager (ARNm) ca purtător de enzime pentru producerea de biblioteci. Captura hibridă a detectat ARN-ul E. coli în biblioteca de gene, pe care cercetătorii l-au examinat individual și au folosit-o ca controale interne.

Pentru a investiga în continuare selecțiile în datele de secvențiere tARC, cercetătorii au cartografiat frecvențele variantelor de tip nonsens, sinonime și nesinonime identificate prin secvențierea tARC în proteina monostructurală 12 (nsp12), o genă critică care codifică SARS-CoV-2 RdRp.

Ei au determinat scorurile acțiunii evolutive (EA) și frecvențele de variație pentru polimorfismele unice de nucleotide (SNP) de tip nonsens și non-sinonime găsite în SARS-CoV-2 Spike (S) și nsp12. Ei au calculat, de asemenea, frecvența medie de mutație a cadrelor deschise de citire (ORF) în virusul de tip sălbatic, defalcate după tipul de mutație și modificările de bază.

Cercetătorii au examinat distribuția aleatorie a variantelor de ARN în genomul SARS-CoV-2 utilizând estimarea bazată pe locație și analiza identității nucleotidelor. De asemenea, au folosit tARC-seq pe două probe clinice pentru a căuta mutații de novo cauzate de infecții spontane.

Ei au atribuit cele mai comune zece mutații C>TT și G>AA la site-urile de editare A3A cunoscute în virusul de tip sălbatic. Cercetătorii au examinat toate aparițiile SID cu ≥2 nucleotide de complementaritate între situsurile donor și acceptoare în aval în WT, Alpha și Omicron. Ei au examinat prevalența la nivelul genomului a mutațiilor TC>TT în celulele WT Vero.

Rezultate

Cercetătorii au descoperit 2,7 × 10-5 (medie) erori de novo pe ciclu în virusul SARS-CoV-2, cu prejudecăți C>T care nu se datorează în principal editării enzimei de editare a ARNm apolipoproteinei B polipeptidei catalitice (APOBEC).

Ei au identificat regiuni reci și fierbinți din genom în funcție de concentrația scăzută sau ridicată de GC, evidențiind regiunile de reglementare transcripțională ca site-uri mai predispuse la erori. Abordarea tARC-seq permite detectarea modificărilor șablonului, cum ar fi ștergeri, inserări și modificări complicate.

Virusul WT are 1,1 × 10-4 variații de ARN pe bază, substituțiile de baze reprezentând majoritatea (8,4 × 10-5), urmate de inserții (2,5 × 10-6) și deleții (2,1 × 10-5). Tranzițiile G > A și C > T domină peisajul mutațiilor virale, reprezentând 9,0% și, respectiv, 44% din toate aparițiile.

Spectrul de mutații și frecvența citirilor în afara țintei SARS-CoV-2 de tip sălbatic sunt diferite de cele ale E. coli, demonstrând că aceste evenimente de mutație sunt adevărate schimbări virale și nu artefacte ale pregătirii bibliotecii.

Distribuțiile aleatoare și ratele comparabile ale tuturor celor trei tipuri de mutații nsp12 sugerează că majoritatea variațiilor ARN găsite prin secvențierea tARC au fost erori de replicare de tip de novo. Cercetătorii nu au găsit diferențe în frecvențele variante între SNP-urile cu valori scăzute de acțiune evolutivă (efecte neutre estimate) și cele cu valori mari EA (efecte dăunătoare estimate) în intervalul de substituție de bază, sugerând că selecția are doar o influență limitată.

Ratele variantelor variază semnificativ între site-uri, cu 643 de loci prezentând frecvențe de substituție a bazei semnificativ mai mari în duplicatele virusului WT și 80 recurent în ambele replicate WT.

Cercetătorii nu au găsit nicio suprapunere între punctele fierbinți C>TT cu cea mai înaltă frecvență din secvențierea tARC și regiunile de editare A3A din virusul de tip sălbatic. Frecvențele C>TT de secvențiere tARC în regiunile de editare A3A au fost cu unul până la două ordine de mărime mai mici decât punctele fierbinți C>TT de secvențiere tARC cu cea mai înaltă frecvență.

Studiul a evidențiat tARC-seq, o abordare specializată de secvențiere pentru a investiga erorile de replicare care influențează divergența SARS-CoV-2. Această abordare citește selectiv moleculele de ARN specifice pentru a genera o secvență consens, permițând cercetătorilor să detecteze și să evalueze diferențele și erorile minore în timpul replicării virusului.

De asemenea, poate detecta inserții și ștergeri de novo în SARS-CoV-2 rezultate din infecția culturii celulare, confirmând rezultatele secvențierii pandemiei globale.

Studiul a mai constatat că SARS-CoV-2 are capacități de corectare a exonucleazei, ceea ce poate ajuta la înțelegerea funcției cruciale a ExoN.

Surse: