Nová metóda tARC-seq zlepšuje presnosť pri sledovaní mutácií SARS-CoV-2

Nová metóda tARC-seq zlepšuje presnosť pri sledovaní mutácií SARS-CoV-2

V nedávnej štúdii publikovanej v Nature Microbiology výskumníci vyvinuli cielený a presný prístup konsenzuálneho sekvenovania ribonukleovej kyseliny (RNA) (tARC-seq) na presné určenie frekvencií a typov mutácií koronavírusu 2 (SARS-CoV-2) závažného akútneho respiračného syndrómu v bunkových kultúrach a klinických vzorkách.

pozadia

SARS-CoV-2 sa replikuje prostredníctvom RNA-dependentných RNA polymeráz (RdRp), ktoré sú náchylné na chyby. Monitorovanie chýb replikácie je rozhodujúce pre pochopenie vývoja vírusov. Existujúce prístupy však nie sú dostatočné na identifikáciu zriedkavých de novo zmien ribonukleovej kyseliny.

Počas pandémie koronavírusovej choroby 2019 (COVID-19) sa miera mutácií SARS-CoV-2 pohybovala od 10-6 do 10-4 na bázu na bunku. Aktivita korektúry exonukleáz zvyšuje mieru mutácií, čo má za následok priemerne dve mutácie v každom genóme za mesiac.

O štúdiu

V tejto štúdii výskumníci vytvorili tARC-seq na preskúmanie mechanizmov chýb replikácie ovplyvňujúcich divergenciu SARS-CoV-2.

Prístup tARC-seq kombinuje funkcie ARC-seq s technológiou hybridného získavania na zlepšenie cieľov a umožnenie podrobného variantného skúmania týchto vzoriek.

Výskumníci použili tARC-seq na detekciu variácií RNA v pôvodnom kmeni SARS-CoV-2 divokého typu (WT), SARS-CoV-2 alfa a Omicron variantoch a klinických a Omicronových vzorkách.

Vedci sekvenovali RNA divokého typu SARS-CoV-2 po 4,0 cykloch infekcie a vytvorili 9,0 × 105 jednotiek tvoriacich plak (pf.u.) SARS-CoV-2 RNA. DoplniliE. coliMessenger RNA (mRNA) ako nosič enzýmu na tvorbu knižníc. Hybridný záchyt detegoval RNA E. coli v génovej knižnici, ktorú vedci skúmali individuálne a použili ako interné kontroly.

Na ďalšie skúmanie výberov v údajoch o sekvenovaní tARC výskumníci zmapovali frekvencie nezmyselného typu, synonymné a nesynonymné varianty identifikované sekvenovaním tARC v monoštrukturálnom proteíne 12 (nsp12), kritickom géne kódujúcom SARS-CoV-2 RdRp.

Stanovili skóre evolučného pôsobenia (EA) a variačné frekvencie pre nezmyselné a nesynonymné jednonukleotidové polymorfizmy (SNP), ktoré sa nachádzajú v SARS-CoV-2 Spike (S) a nsp12. Vypočítali tiež priemernú frekvenciu mutácií otvorených čítacích rámcov (ORF) vo víruse divokého typu, rozčlenenú podľa typu mutácie a zmien báz.

Výskumníci skúmali náhodnú distribúciu variantov RNA v genóme SARS-CoV-2 pomocou odhadu založeného na polohe a analýzy nukleotidovej identity. Použili tiež tARC-seq na dvoch klinických vzorkách na hľadanie de novo mutácií spôsobených spontánnymi infekciami.

Známym miestam úpravy A3A vo víruse divokého typu priradili desať najbežnejších mutácií C>TT a G>AA. Výskumníci skúmali všetky výskyty SID s ≥ 2 nukleotidmi komplementarity medzi donorovými a akceptorovými miestami po prúde vo WT, Alpha a Omicron. Skúmali prevalenciu mutácií TC>TT v bunkách WT Vero v celom genóme.

Výsledky

Výskumníci našli 2,7 × 10-5 (priemer) de novo chýb na cyklus vo víruse SARS-CoV-2, pričom odchýlky C>T nie sú primárne spôsobené úpravou mRNA-editujúceho enzýmu apolipoproteínu B katalytického polypeptidu (APOBEC).

Identifikovali chladné a horúce oblasti v genóme v závislosti od nízkej alebo vysokej koncentrácie GC, pričom zdôraznili transkripčné regulačné oblasti ako miesta náchylnejšie na chyby. Prístup tARC-seq umožňuje detekciu zmien templátu, ako sú delécie, inzercie a komplikované zmeny.

Vírus WT má 1,1 x 10-4 variácií RNA na bázu, pričom väčšinu tvoria substitúcie báz (8,4 x 10-5), po ktorých nasledujú inzercie (2,5 x 10-6) a delécie (2,1 x 10-5). V prostredí vírusových mutácií dominujú prechody G > A a C > T, ktoré predstavujú 9,0 % a 44 % všetkých výskytov.

Spektrum a frekvencia mutácií divokého typu SARS-CoV-2 mimo cieľa sa líši od čítania E. coli, čo dokazuje, že tieto udalosti mutácie sú skutočnými vírusovými zmenami a nie artefaktmi prípravy knižnice.

Náhodné distribúcie a porovnateľné miery všetkých troch typov mutácií nsp12 naznačujú, že väčšina variácií RNA zistených sekvenovaním tARC boli chyby replikácie de novo. Výskumníci nenašli žiadne rozdiely vo variantných frekvenciách medzi SNP s nízkymi evolučnými akčnými hodnotami (odhadované neutrálne účinky) a s vysokými hodnotami EA (odhadované škodlivé účinky) v rámci základného rozsahu substitúcie, čo naznačuje, že výber má len obmedzený vplyv.

Miery variantov sa medzi miestami výrazne líšia, pričom 643 lokusov vykazuje významne vyššie frekvencie substitúcie báz v duplikátoch vírusu WT a 80 sa opakuje v oboch replikáciách WT.

Výskumníci nezistili žiadne prekrývanie medzi najčastejšími aktívnymi bodmi C>TT zo sekvenovania tARC a oblasťami úpravy A3A vo víruse divokého typu. Frekvencie sekvenovania tARC C> TT v oblastiach úprav A3A boli o jeden až dva rády nižšie ako aktívne body C> TT sekvenovania tARC s najvyššou frekvenciou.

Štúdia zdôraznila tARC-seq, špecializovaný sekvenčný prístup na skúmanie chýb replikácie, ktoré ovplyvňujú divergenciu SARS-CoV-2. Tento prístup selektívne číta určité molekuly RNA na vytvorenie konsenzuálnej sekvencie, čo umožňuje výskumníkom odhaliť a vyhodnotiť menšie rozdiely a chyby počas replikácie vírusu.

Môže tiež detekovať de novo inzercie a delécie v SARS-CoV-2 vyplývajúce z infekcie bunkovej kultúry, čo potvrdzuje výsledky globálneho sekvenovania pandémie.

Štúdia tiež zistila, že SARS-CoV-2 má schopnosti korektúry exonukleázy, čo môže pomôcť pochopiť kľúčovú funkciu ExoN.

Zdroje: