Ny tARC-seq-metod förbättrar precisionen vid spårning av SARS-CoV-2-mutationer

Ny tARC-seq-metod förbättrar precisionen vid spårning av SARS-CoV-2-mutationer

I en nyligen publicerad studie publicerad i Nature Microbiology utvecklade forskare en målinriktad, noggrann ribonukleinsyra (RNA) konsensussekvensering (tARC-seq) tillvägagångssätt för att exakt bestämma allvarligt akut respiratoriskt syndrom coronavirus 2 (SARS-CoV-2) mutationsfrekvenser och -typer i cellkultur och kliniska prover.

bakgrund

SARS-CoV-2 replikerar via RNA-beroende RNA-polymeraser (RdRp), som är felbenägna. Övervakning av replikeringsfel är avgörande för att förstå virusutvecklingen. Befintliga tillvägagångssätt är dock inte tillräckliga för att identifiera sällsynta de novo ribonukleinsyraförändringar.

Under pandemin av coronavirussjukdomen 2019 (COVID-19) varierade mutationshastigheterna för SARS-CoV-2 från 10–6 till 10–4 per bas och cell. Exonukleas korrekturläsningsaktivitet ökar mutationshastigheten, vilket resulterar i i genomsnitt två mutationer i varje genom per månad.

Om studien

I den aktuella studien skapade forskare tARC-seq för att undersöka mekanismerna för replikeringsfel som påverkar SARS-CoV-2-divergens.

tARC-seq-metoden kombinerar ARC-seq-funktioner med hybrid förvärvsteknologi för att förbättra mål och möjliggöra detaljerad variantutfrågning av dessa prover.

Forskarna använde tARC-seq för att detektera RNA-variationer i den ursprungliga SARS-CoV-2-vildtypsstammen (WT), SARS-CoV-2 alfa- och Omicron-varianterna och kliniska prover och Omicron-prover.

Forskarna sekvenserade SARS-CoV-2 vildtyps-RNA efter 4,0 infektionscykler och genererade 9,0 × 105 plackbildande enheter (pf.u.) SARS-CoV-2-RNA. De tilladeE. coliMessenger RNA (mRNA) som en enzymbärare för produktion av bibliotek. Hybridinfångning upptäckte E. coli RNA i genbiblioteket, som forskarna undersökte individuellt och använde som interna kontroller.

För att ytterligare undersöka urval i tARC-sekvenseringsdata, kartlade forskare frekvenserna av nonsens-typ, synonyma och icke-synonyma varianter identifierade av tARC-sekvensering i monostrukturellt protein 12 (nsp12), en kritisk gen som kodar för SARS-CoV-2 RdRp.

De fastställde evolutionär verkan (EA) poäng och variationsfrekvenser för nonsens-typ och icke-synonyma singelnukleotidpolymorfismer (SNP) som finns i SARS-CoV-2 Spike (S) och nsp12. De beräknade också den genomsnittliga mutationsfrekvensen för de öppna läsramarna (ORF) i vildtypsviruset, uppdelat efter mutationstyp och basförändringar.

Forskarna undersökte den slumpmässiga fördelningen av RNA-varianter i SARS-CoV-2-genomet med hjälp av lokaliseringsbaserad uppskattning och nukleotididentitetsanalys. De använde också tARC-seq på två kliniska prover för att leta efter de novo-mutationer orsakade av spontana infektioner.

De tilldelade de tio vanligaste C>TT- och G>AA-mutationerna till kända A3A-redigeringsställen i vildtypsviruset. Forskarna undersökte alla SID-förekomster med ≥2 nukleotider av komplementaritet mellan donator- och acceptorställen nedströms i WT, Alpha och Omicron. De undersökte den genomomfattande prevalensen av TC>TT-mutationer i WT Vero-celler.

Resultat

Forskare fann 2,7 × 10−5 (medelvärde) de novo-fel per cykel i SARS-CoV-2-viruset, med C>T-biaser som inte primärt berodde på redigering av det mRNA-redigerande enzymet apolipoprotein B katalytisk polypeptid (APOBEC).

De identifierade svala och varma regioner över genomet beroende på låg eller hög GC-koncentration, vilket framhävde transkriptionella regulatoriska regioner som platser som är mer benägna att fel. tARC-seq-metoden möjliggör detektering av malländringar såsom raderingar, infogningar och komplicerade ändringar.

WT-viruset har 1,1 × 10-4 RNA-variationer per bas, med bassubstitutioner som står för majoriteten (8,4 × 10-5), följt av insättningar (2,5 × 10-6) och deletioner (2,1 × 10-5). Övergångarna G > A och C > T dominerar det virala mutationslandskapet och står för 9,0 % respektive 44 % av alla förekomster.

Mutationsspektrumet och frekvensen av avläsningar av vildtyp SARS-CoV-2 utanför målet skiljer sig från de för E. coli, vilket visar att dessa mutationshändelser är sanna virala förändringar och inte artefakter av biblioteksberedning.

Slumpmässiga fördelningar och jämförbara frekvenser av alla tre nsp12-mutationstyper tyder på att de flesta RNA-variationer som hittats av tARC-sekvensering var replikationsfel av de novo-typ. Forskarna fann inga skillnader i variantfrekvenser mellan SNP:er med låga evolutionära aktionsvärden (uppskattade neutrala effekter) och de med höga EA-värden (uppskattade skadliga effekter) över bassubstitutionsområdet, vilket tyder på att urvalet endast har ett begränsat inflytande.

Varianthastigheter varierar avsevärt mellan platser, med 643 loci som visar signifikant högre bassubstitutionsfrekvenser i WT-virusduplikat och 80 återkommande i båda WT-replikaten.

Forskarna fann ingen överlappning mellan C>TT-hotspots med högsta frekvens från tARC-sekvensering och A3A-redigeringsregionerna i vildtypsviruset. tARC-sekvenserings C>TT-frekvenserna i A3A-redigeringsregioner var en till två storleksordningar lägre än de högsta frekvenserna för tARC-sekvensering C>TT-hotspots.

Studien lyfte fram tARC-seq, en specialiserad sekvenseringsmetod för att undersöka replikeringsfelen som påverkar SARS-CoV-2-divergensen. Detta tillvägagångssätt läser selektivt vissa RNA-molekyler för att generera en konsensussekvens, vilket gör det möjligt för forskare att upptäcka och utvärdera mindre skillnader och fel under virusreplikering.

Det kan också upptäcka de novo-insättningar och deletioner i SARS-CoV-2 till följd av cellkulturinfektion, vilket bekräftar globala pandemisekvenseringsresultat.

Studien fann också att SARS-CoV-2 har exonukleas korrekturläsningsförmåga, vilket kan hjälpa till att förstå den avgörande funktionen av ExoN.

Källor: