新的 tARC-seq 方法提高了追踪 SARS-CoV-2 突变的精度

新的 tARC-seq 方法提高了追踪 SARS-CoV-2 突变的精度

在《自然微生物学》最近发表的一项研究中，研究人员开发了一种有针对性的、准确的核糖核酸 (RNA) 一致性测序 (tARC-seq) 方法，以准确确定细胞培养物和临床样本中的严重急性呼吸综合征冠状病毒 2 (SARS-CoV-2) 突变频率和类型。

背景

SARS-CoV-2 通过 RNA 依赖性 RNA 聚合酶 (RdRp) 进行复制，这种酶很容易出错。 监控复制错误对于了解病毒进化至关重要。然而，现有方法不足以识别罕见的从头核糖核酸改变。

在 2019 年冠状病毒病 (COVID-19) 大流行期间，SARS-CoV-2 突变率范围为每个细胞每个碱基 10−6 到 10−4 个。 核酸外切酶校对活动会增加突变率，导致每个基因组平均每月出现两次突变。

关于该研究

在本研究中，研究人员创建了 tARC-seq 来研究复制错误影响 SARS-CoV-2 分歧的机制。

tARC-seq 方法将 ARC-seq 功能与混合采集技术相结合，以改进目标并能够对这些样本进行详细的变异询问。

研究人员使用 tARC-seq 检测原始 SARS-CoV-2 野生型 (WT) 毒株、SARS-CoV-2 α 和 Omicron 变体以及临床和 Omicron 样本中的 RNA 变异。

研究人员在 4.0 个感染周期后对 SARS-CoV-2 野生型 RNA 进行了测序，并生成了 9.0 × 105 空斑形成单位 (pf.u.) SARS-CoV-2 RNA。 他们补充说大肠杆菌信使 RNA (mRNA) 作为酶载体用于文库生产。 杂交捕获在基因库中检测到了大肠杆菌 RNA，研究人员对其进行了单独检查并用作内部对照。

为了进一步研究 tARC 测序数据的选择，研究人员绘制了单结构蛋白 12 (nsp12)（编码 SARS-CoV-2 RdRp 的关键基因）中通过 tARC 测序鉴定的无义类型、同义和非同义变异的频率。

他们确定了 SARS-CoV-2 Spike (S) 和 nsp12 中发现的无义型和非同义单核苷酸多态性 (SNP) 的进化作用 (EA) 评分和变异频率。 他们还计算了野生型病毒中开放阅读框（ORF）的平均突变频率，按突变类型和碱基变化进行细分。

研究人员使用基于位置的估计和核苷酸同一性分析检查了 SARS-CoV-2 基因组中 RNA 变异的随机分布。 他们还在两个临床样本上使用 tARC-seq 来寻找由自发感染引起的新生突变。

他们将十种最常见的 C>TT 和 G>AA 突变分配给野生型病毒中已知的 A3A 编辑位点。 研究人员检查了 WT、Alpha 和 Omicron 下游供体和受体位点之间具有 ≥2 个核苷酸互补性的所有 SID 发生情况。 他们检查了 WT Vero 细胞中 TC>TT 突变的全基因组患病率。

结果

研究人员发现 SARS-CoV-2 病毒每个周期有 2.7 × 10−5（平均）从头错误，其中 C>T 偏差主要不是由于 mRNA 编辑酶载脂蛋白 B 催化多肽 (APOBEC) 的编辑所致。

他们根据GC浓度的低或高确定了基因组中的冷区和热区，强调转录调控区域是更容易出错的位点。 tARC-seq 方法能够检测模板变化，例如删除、插入和复杂的变化。

WT病毒每个碱基有1.1×10-4个RNA变异，其中碱基替换占大多数（8.4×10-5），其次是插入（2.5×10-6）和缺失（2.1×10-5）。 G > A 和 C > T 转变在病毒突变格局中占主导地位，分别占所有突变的 9.0% 和 44%。

野生型 SARS-CoV-2 脱靶读段的突变谱和频率与大肠杆菌不同，表明这些突变事件是真正的病毒变化，而不是文库制备的产物。

所有三种 nsp12 突变类型的随机分布和可比率表明，tARC 测序发现的大多数 RNA 变异都是从头型复制错误。 研究人员发现，在整个碱基替代范围内，具有低进化作用值（估计中性效应）的SNP和具有高EA值（估计有害效应）的SNP之间的变异频率没有差异，这表明选择的影响有限。

位点之间的变异率差异显着，其中 643 个位点在 WT 病毒重复中显示出显着较高的碱基替换频率，而 80 个位点在两个 WT 重复中重复出现。

研究人员发现 tARC 测序中出现频率最高的 C>TT 热点与野生型病毒的 A3A 编辑区域之间没有重叠。 A3A 编辑区域中的 tARC 测序 C>TT 频率比最高频率 tARC 测序 C>TT 热点低一到两个数量级。

该研究重点介绍了 tARC-seq，这是一种专门的测序方法，用于研究影响 SARS-CoV-2 分歧的复制错误。 这种方法选择性地读取某些 RNA 分子以生成共有序列，使研究人员能够检测和评估病毒复制过程中的微小差异和错误。

它还可以检测细胞培养物感染引起的 SARS-CoV-2 中的从头插入和缺失，从而证实全球大流行测序结果。

研究还发现SARS-CoV-2具有核酸外切酶校对能力，这可以帮助理解ExoN的关键功能。

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