Strukturanalyse des Affenpockenvirus als Leitfaden für die Entwicklung umfassender antiviraler Wirkstoffe

In einer aktuellen Studie, die im veröffentlicht wurde bioRxiv* Preprint-Server: Forscher untersuchten die kristalline Struktur des Affenpockenvirus (MPX) (MPXV) und den Komplex aus VP39, einer 2′-O-RNA-Methyltransferase (MTase) und Sinefungin, einem Pan-MTase-Inhibitor.

Studie: Die Struktur der 2′-O-Ribose-Methyltransferase VP39 des Affenpockenvirus im Komplex mit Sinefungin bildet die Grundlage für das Inhibitordesign. Bildnachweis: Marina Demidiuk/Shutterstock

Bei diesem Nachrichtenartikel handelte es sich um eine Rezension eines vorläufigen wissenschaftlichen Berichts, der zum Zeitpunkt der Veröffentlichung noch keinem Peer-Review unterzogen worden war. Seit seiner Erstveröffentlichung wurde der wissenschaftliche Bericht nun einem Peer-Review unterzogen und zur Veröffentlichung in einer wissenschaftlichen Zeitschrift angenommen. Links zu den vorläufigen und von Experten überprüften Berichten finden Sie im Abschnitt „Quellen“ am Ende dieses Artikels. Quellen anzeigen

Die Zahl der MPX-Fälle steigt weltweit stündlich an und könnte auf eine neue Pandemie hinweisen. Die Strukturanalyse von MPXV könnte bei der Entwicklung wirksamer antiviraler Wirkstoffe zur Bekämpfung von MPXV hilfreich sein. Pockenviren kodieren Enzyme vom Decapping-Typ, um die Ansammlung doppelsträngiger Ribonukleinsäure (dsRNA) während einer Infektion zu verhindern, die angeborene antivirale Immunantworten auslösen könnte. MPXV kodiert für das Pockenenzym, das den durch ds-Desoxyribonukleinsäure (dsDNA) ausgelösten cGAS-STING-Weg (zyklischer GMP-AMP-Synthase-Stimulator von Interferon-Genen) hemmt.

Die Methylierung des anfänglichen Nukleotids (nt) des reifen MPXV-Caps (oder Cap-1) an der 2′-O-Ribose-Position wurde dokumentiert. MTase wird von der Familie der Poxviridiae-Viren (einschließlich MPXV) für die Cap-0-Synthese benötigt und durch Hinzufügen einer weiteren Methylgruppe an der 2′-O-Position der proximalen Ribose kann das unreife Cap (Cap-0) in das reife umgewandelt werden Deckel. Der Schritt ist wichtig für die Verhinderung der Entwicklung angeborener Immunantworten und wird durch VP39, die 2′-O MTase von MPXV, katalysiert.

Über die Studie

In der vorliegenden Studie untersuchten die Forscher die VP39-Sinefungin-Komplexstruktur von MPXV, um das Verständnis der Mechanismen der Hemmung des VP39-Moleküls durch Sinefungin zu verbessern. Sie verglichen die Struktur auch mit 2′-O-MTasen von einzelsträngigen RNA-Viren (ssRNA) wie dem Zika-Virus und dem schweren akuten respiratorischen Syndrom-Coronavirus 2 (SARS-CoV-2).

Das VP39-Gen des MPXV USA-May22-Stamms wurde für die Expression in E. coli für die anschließende Synthese und Klonierung codonoptimiert. E. coli BL21-Zellen wurden mit VP39-exprimierendem Plasmid umgewandelt und IPTG (Isopropyl-bD-thiogalactopyranosid) hinzugefügt, woraufhin das rekombinante VP39 gereinigt wurde. Die Zellen wurden zentrifugiert, lysiert und das Lysat einer chromatographischen Analyse unterzogen. VP39 wurde konzentriert und mit Sinefungin für kristallisationsbasierte Versuche gemischt.

Die ursprünglich gebildeten Kristalle wurden zerkleinert und Impfsiebe und RNA-Substrate wurden durch In-vitro-Transkription hergestellt. Anschließend wurden 2´-O-MTase-Assays und Echo-Massenspektrometrie-Analysen durchgeführt. Die Rate der MTase-Aktivität, die 2′-O-MTase-Hemmung durch Sinefungin und die Substratumwandlungsraten (SAM) wurden bestimmt, und die Werte der halbmaximalen Hemmkonzentration (IC50) wurden bestimmt.

Der kristallographische Datensatz der erhaltenen Beugungskristalle wurde analysiert. Die Strukturmerkmale des VP39/Sinefungin-Komplexes wurden unter Verwendung der molekularen Substitutionsmethode mit der Vacciniavirus-VP39/SAH-Komplexstruktur als Suchmodell untersucht. Zur Überprüfung der enzymatischen Aktivität von rekombinantem VP39 wurden zwei Substrate mit unterschiedlichen vorletzten Basen (m7GpppA-RNA und m7GpppG-RNA) getestet.

Die VP39-Sinefungin-Wechselwirkungen wurden analysiert, indem ein Modell des Sinefungin:RNA:VP39-Komplexes erstellt wurde, um die molekularen Mechanismen zu veranschaulichen, die der VP39-Hemmung durch Sinefungin zugrunde liegen. Darüber hinaus wurden die katalytischen Stellen von VP39 mit denen von 2′-O-Ribose-MTasen aus entfernten Zika-Viren und SARS-CoV-2 verglichen.

Ergebnisse

Die MPX-Struktur umfasste eine Rossman-Faltung, die der Alpha/Beta-Faltung (α/β) ähnelte, wobei das zentral gelegene β-Faltblatt β2-β10 in einem Muster umfasste, das dem J-Buchstaben ähnelte. Bemerkenswerterweise wurde das Muster auch für das 2′-O MTase-Nichtstrukturprotein (nsp)1614 von SARS-CoV-2 gefunden. Das zentrale β-Faltblatt wurde an einem Ende durch Alpha-1-, Alpha2-, Alpha-6- und Alpha-7-Helices und am anderen Ende durch die Alpha-3- und Alpha-7-Helices befestigt, und die Seiten waren durch β1 verbunden. β11 und α5.

Beide RNAS-Substrate erwiesen sich als akzeptabel; jedoch war diejenige mit einer vorletzten Guaninbase vorzuziehen. Sinefungin hemmte VP39 mit einem IC50-Wert von 41 µM. Es wurde festgestellt, dass Sinefungin die SAM-Tasche mit seiner Adeninbase-Einheit besetzt, die sich in einer tief gelegenen Schlucht befindet, die von hydrophoben Seitenketten der Val116-, Phe115-, Leu159- und Val139-Reste mit Wasserstoffbrückenbindungen ausgekleidet ist. Sinefungin schützte effizient die 2′-O-Ribose-Region mit seinen Aminogruppen in der Nähe der 2′-Ribose-Region, wo sich sonst das Schwefelatom von SAM befinden würde.

Die SAM-Schlucht hatte zwei Enden, von denen ein Ende, das an die RNA-Tasche grenzte, für die Positionierung von SAM für Methyltransferase-Reaktionen von entscheidender Bedeutung war und das gegenüberliegende Ende, das sich neben der Adeninbase des Sinefungins befand, unbesetzt war. Bei näherer Betrachtung zeigte sich an der Stelle ein komplexes Wassermolekülnetzwerk, das durch Wasserstoffbrückenbindungen verbunden und an die Reste Glu118, Asn156 und Val116 sowie die Adenineinheit gebunden ist.

Sinefungin-Gerüstmoleküle mit Einheiten, die die Wassermoleküle verdrängen und direkt mit den Glu118-, Asn156- und Val116-Resten interagieren könnten, könnten außergewöhnlich gute Bindemittel sein, da die Verdrängung der Wassermoleküle günstige entropische Effekte hervorrufen könnte. Die Ähnlichkeit der MPXV-SAM-Bindungsstelle mit Zika und SARS-CoV-2 war bemerkenswert. Identische Konformationen wurden zwischen Sinefungin und den NS5-, nsp16- und VP39-Proteinen von Zika, SARS-CoV-2 bzw. MPXV beobachtet.

Die katalytische Resttetrade (Asp138, Lys41, Glu218 und Lys175) für MPXV war unter den drei getesteten entfernten Viren konserviert, einschließlich der Restkonformationen. Darüber hinaus nutzten alle Viren einen Aspartatrest zur Interaktion mit der Aminogruppe von Sinefungin. Die konservierten Bindungsmodi zwischen den drei Viren deuteten darauf hin, dass ein einzelner MTase-Inhibitor möglicherweise als pan-antivirales Mittel verwendet werden könnte. Es wurden jedoch Unterschiede in den Bindungsmodi der Nukleobasen und des Riboserings beobachtet.

Insgesamt zeigten die Studienergebnisse, dass MTase-basierte Inhibitoren pan-antivirale Ziele sein könnten.

Bei diesem Nachrichtenartikel handelte es sich um eine Rezension eines vorläufigen wissenschaftlichen Berichts, der zum Zeitpunkt der Veröffentlichung noch keinem Peer-Review unterzogen worden war. Seit seiner Erstveröffentlichung wurde der wissenschaftliche Bericht nun einem Peer-Review unterzogen und zur Veröffentlichung in einer wissenschaftlichen Zeitschrift angenommen. Links zu den vorläufigen und von Experten überprüften Berichten finden Sie im Abschnitt „Quellen“ am Ende dieses Artikels. Quellen anzeigen

Referenzen:

• Vorläufiger wissenschaftlicher Bericht.
  Jan Silhan, Martin Klima, Dominika Chalupska, Jan Kozic, Evzen Boura. (2022). Die Struktur der 2′-O-Ribose-Methyltransferase VP39 des Affenpockenvirus im Komplex mit Sinefungin bildet die Grundlage für das Inhibitordesign. bioRxiv. doi: https://doi.org/10.1101/2022.09.27.509668 https://www.biorxiv.org/content/10.1101/2022.09.27.509668v1
• Von Experten begutachteter und veröffentlichter wissenschaftlicher Bericht.
  Silhan, Jan, Martin Klima, Tomas Otava, Petr Skvara, Dominika Chalupska, Karel Chalupsky, Jan Kozic, Radim Nencka und Evzen Boura. 2023. „Entdeckung und strukturelle Charakterisierung von Monkeypox-Virus-Methyltransferase-VP39-Inhibitoren zeigen Ähnlichkeiten mit SARS-CoV-2-Nsp14-Methyltransferase.“ Naturkommunikation 14 (1). https://doi.org/10.1038/s41467-023-38019-1. https://www.nature.com/articles/s41467-023-38019-1.

Artikelrevisionen

• 15. Mai 2023 – Das vorab gedruckte vorläufige Forschungspapier, auf dem dieser Artikel basiert, wurde zur Veröffentlichung in einer von Experten begutachteten wissenschaftlichen Zeitschrift angenommen. Dieser Artikel wurde entsprechend bearbeitet und enthält nun einen Link zum endgültigen, von Experten begutachteten Artikel, der jetzt im Abschnitt „Quellen“ angezeigt wird.