Kompaktes Schnellerkennungskit zum Testen auf Affenpockenviren zeigt vielversprechende Ergebnisse in neuer Forschung
In einem aktuellen Bericht in der Zeitschrift Reisemedizin und Infektionskrankheitenstellten Forscher ein kompaktes Schnellerkennungskit vor, das mithilfe einer Kombination aus Rekombinase-Polymerase-Amplifikation (RPA) und Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats (CRISPR)-Technologie auf Affenpockenviren testet.
Lernen: Taschenlabor zum schnellen Nachweis des Affenpockenvirus. Bildquelle: Tatiana Buzmakova/Shutterstock
Hintergrund
Der Affenpocken-Ausbruch hat sich im Jahr 2022 weit über die endemischen Länder West- und Zentralafrikas hinaus ausgebreitet, und die Weltgesundheitsorganisation (WHO) hat ihn nun zu einem gesundheitlichen Notfall von internationaler Tragweite erklärt. Der ätiologische Erreger der Affenpocken ist das Affenpockenvirus, das zur Gattung der Orthopoxviren gehört.
Der derzeit verwendete Test zum Nachweis von Affenpocken ist der Polymerase-Kettenreaktionstest (PCR), der die Desoxyribonukleinsäure (DNA) des Orthopoxvirus oder spezifischer Affenpockenviren amplifiziert. Allerdings ist die PCR ein langwieriger Prozess, der einen Thermocycler, geschultes Personal und ein Labor erfordert.
Die frühzeitige Erkennung und Eindämmung infizierter Personen ist für die Kontrolle eines Krankheitsausbruchs unerlässlich. Immunoassays wie Lateral-Flow-Streifen sind einfacher und schneller als PCRs, weisen jedoch eine höhere Kreuzreaktivität für Orthopoxviren auf, was den genauen Nachweis von Affenpocken erschwert. Daher ist eine Technologie, die Affenpocken schnell erkennt und genaue und zuverlässige Ergebnisse liefert, von entscheidender Bedeutung.
Erkennungsmechanismus
In der vorliegenden Studie entwickelten die Forscher ein Schnellerkennungskit oder ein Taschenlabor zum Testen auf das Affenpockenvirus. Das Detektionskit nutzt die Prinzipien der RPA- und CRISPR-Technologie, um die Spezifität und Empfindlichkeit der Analyse zu erhöhen. Die RPA verstärkt Zielgene des Affenpockenvirus, die von der CRISPR-Leit-Ribonukleinsäure (RNA) und dem CRISPR-assoziierten Protein 12a (Cas12a)-Enzym gescannt werden.
Die CRISPR/Cas12sa-vermittelte Spaltung der Sequenz erfolgt nur, wenn die Ziel-Amplikons der Affenpocken erkannt werden, wodurch die Möglichkeit unspezifischer Signale ausgeschlossen wird. Die Spaltung führt zu Fluoreszenz, was auf Affenpocken-positive Proben hinweist.
Taschenlabor
Das Kit wog 500 g und das Gehäuse war wasserdicht und kompakt genug, um in eine Tasche zu passen. Die Komponenten bestanden aus zwei dreidimensional gedruckten Heizblöcken – Block A, der die Proben für die Lyse der Virushülle auf 80 °C erhitzt, und Block B, der die Proben für die DNA-Amplifikation auf 40 °C erhitzt.
Das Kit enthielt Röhrchen mit Trehalose-geschützten lyophilisierten Enzymen und Probenröhrchen mit Natriumchlorid- und Magnesiumacetatlösung. Ein Rehydrierungspuffer mit Primern und dem Fluoreszenzreporter sowie eine Ultraviolett-Taschenlampe (UV) zur Erkennung der Fluoreszenz waren ebenfalls im Kit enthalten.
Beim Testvorgang wird die Probe in das Probenröhrchen gegeben und die Virushülle mithilfe eines Heizblocks A lysiert. Die erhitzte Probe wird in das Röhrchen mit den lyophilisierten Enzymen gegeben und mit dem Rehydrierungspuffer versetzt. Anschließend wird Heizblock B zur Verstärkung der Zielregion eingesetzt. Abschließend wird mit der UV-Taschenlampe die Fluoreszenz nachgewiesen.
Während des Versuchstests führten die Forscher pseudotypisierte Affenpockenvirusproben durch, die Gesamtzeit betrug 25 Minuten, und Proben mit nur zehn Viruspartikeln wurden mit Genauigkeit nachgewiesen.
Schlussfolgerungen
Zusammenfassend stellten die Forscher ein neuartiges Schnellerkennungskit vor, das kompakt war und zum Nachweis des Affenpockenvirus ohne den Einsatz komplizierter Instrumente, geschulter Techniker oder eines Laboraufbaus verwendet werden konnte.
Das Nachweiskit nutzt die Prinzipien von RPA und CRISPR, um Zielregionen der Affenpocken-DNA zu amplifizieren und sie mithilfe des CRISPR/Cas12a-Komplexes zu spalten, wobei ein fluoreszierender Reporter den Nachweis der Affenpocken-Virus-DNA signalisiert.
Die Versuche mit dem pseudotypisierten Virus zeigten einen erfolgreichen und schnellen Nachweis des Affenpockenvirus, was darauf hindeutet, dass das Kit möglicherweise für Schnelltests bei Reisenden und in Gebieten eingesetzt werden kann, in denen es an angemessener medizinischer Infrastruktur und geschultem Personal mangelt.
Referenz:
- Wei, J., Meng, X., Li, J. & Pang, B. (2022). Taschenlabor zum schnellen Nachweis des Affenpockenvirus. Reisemedizin und Infektionskrankheiten. tue ich: https://doi.org/10.1016/j.tmaid.2022.102478 https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S1477893922002241?via%3Dihub
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