In einer aktuellen Studie, die im veröffentlicht wurde bioRxiv* Preprint-Server: Forscher ermittelten, dass die Kristallstruktur der dualen spezifischen H1-Phosphatase (DSP) des Affenpockenvirus (MPXV) mit einer Auflösung von 1,8 Å für die Virusreplikation entscheidend ist und sie zu einem attraktiven antiviralen Ziel macht.
Lernen: Kristallstruktur der Affenpocken-H1-Phosphatase, einem antiviralen Wirkstoffziel. Bildnachweis: Die Fuchswerkstatt/Shutterstock
Bei diesem Nachrichtenartikel handelte es sich um eine Rezension eines vorläufigen wissenschaftlichen Berichts, der zum Zeitpunkt der Veröffentlichung noch keinem Peer-Review unterzogen worden war. Seit seiner Erstveröffentlichung wurde der wissenschaftliche Bericht nun einem Peer-Review unterzogen und zur Veröffentlichung in einer wissenschaftlichen Zeitschrift angenommen. Links zu den vorläufigen und von Experten überprüften Berichten finden Sie im Abschnitt „Quellen“ am Ende dieses Artikels. Quellen anzeigen
Die Zahl der MPX-Fälle steigt weltweit stündlich weiter an, was die Notwendigkeit der Entwicklung wirksamer antiviraler Therapeutika und Impfstoffe rechtfertigt, um die weltweite Vorbereitung auf MPX zu verbessern und Virusinfektionen einzudämmen. H1 ist für die MPXV-Replikation von wesentlicher Bedeutung, da es Proteine wie A14, F18, A17 und den Signalwandler und Aktivator der Transkription 1 (STAT1) dephosphoryliert und die Interferon (IFN)-Signalübertragung hemmt. Wichtig ist, dass HI unter Pockenviren konserviert ist und daher gezielt zur Entwicklung breit angelegter antiviraler Wirkstoffe eingesetzt werden kann.
Über die Studie
In der vorliegenden Studie untersuchten die Forscher die H1-Kristallstruktur mit einer Auflösung von 1,8 Å, um das Verständnis der MPXV-H1-katalysierten Dephosphorylierung zu verbessern und ein präzises Modell für die Entwicklung neuartiger antiviraler Arzneimittel zu entwickeln.
Die Desoxyribonukleinsäure (DNA), die für H1 des aktuellen MPXV-Ausbruchs MPXV_USA_2022_MA001-Isolats im Jahr 2022 kodiert, wurde synthetisiert und in einen Expressionsplasmidvektor kloniert, der durch Sequenzierung verifiziert wurde. H1 wurde in Escherichia coli BL21- (oder DE3-)Zellen exprimiert und H1-exprimierende Bakterien wurden lysiert, woraufhin das Protein einer chromatographischen Analyse unterzogen wurde.
H1 wurde mithilfe der Dampfdiffusionstechnik mit sitzendem Tropfen kristallisiert und die Kristalle wurden einer Röntgenbeugungsanalyse unterzogen. Die H1-Struktur wurde unter Verwendung der molekularen Ersatztechnik mit der H1-Struktur des Vaccinia-Virus als Suchmodell bestimmt. Anschließend wurde ein Strukturvergleich mit humanen Protein-Tyrosin-Phosphatasen (PTP)/DSP-Phosphatasen durchgeführt.
MPXV-H1-Koordinaten wurden auf den Dali-Server hochgeladen und in der PDB (Proteindatenbank) mithilfe der PDB50-Teilmenge nach Proteinen mit ähnlich strukturierten Proteinen gesucht. Als Ergebnis wurden Strukturen von 30 Phosphatasen mit signifikanter struktureller Ähnlichkeit identifiziert (Z-Scores >13). Darunter wurden zwei menschliche Phosphatasen als Dimere kristallisiert: menschliche Dual-Spezifitäts-Phosphatase (hDSP)-5 und 27, und ihre Dimerisierungsmodi wurden verglichen.
Ergebnisse
MPXV H1 umfasste 171 Reste mit gut passenden Elektronendichten, ein asymmetrisches H1-Molekül und zwei symmetrisch ausgerichtete H1-Moleküle, die schmetterlingsförmige und domänenvertauschte Dimere bildeten. Die gesamte H1-Struktur bestand aus sechs bzw. vier Alpha-Helices (α) und Beta-Strängen (β), wobei an den Seiten ein β-Faltblatt zwischen den Helices α2 und α3 bis α6 angeordnet war.
Die beiden aktiven Stellen befanden sich in einem Abstand von 39 Å in der Nähe der C-Terminals des terminalen β-Strangs. Jedes aktive Zentrum umfasste eine Triade aus Cystein (Cys)-Arginin (Arg)-Asparaginsäure (Asp). In jedem aktiven Zentrum befanden sich die konservierten Arg- und Cys-Reste in der Phosphationenbindungsschleife zwischen den α4- und β4-Resten. Der Arg116-Rest der Schleife fing Phosphationen ein, deren Guanidiniumgruppe mit zwei PO-Molekülen (Phosphat-Sauerstoff) interagierte, die durch Wasserstoffbrückenbindungen verbunden waren.
Der Arg116-Rest gewährleistete eine effiziente Substratorientierung und -bindung. Die N-terminalen α1-Helices jedes Protomers wurden ausgetauscht, um H1-Dimerisierungen zu vermitteln. Die α1-Helices eines einzelnen H1-Protomers bildeten eine gebündelte Struktur mit drei α4- bis α6-Helices der entsprechenden an der Paarung beteiligten Promotoren. An der Basis der katalytischen Tasche griff der Cys110-Rest während der Dephosphorylierung Phosphoratome an, was zur vorübergehenden Bildung eines Enzym-Phosphat-Zwischenprodukts führte, das zur Regeneration von anorganischem Phosphat und Enzym hydrolysiert wurde.
Das Schwefelatom des Cys110-Restes war parallel zur PO-Bindung positioniert, was der Bindung entspricht, die bei der Regeneration des Enzyms gebildet wurde. Der Asp79-Rest war an der Koordination mit dem Wassermolekül beteiligt und fungierte als Säure, wodurch die Bildung und Hydrolyse der Zwischenverbindung erleichtert wurde. Somit deutete die H1-Struktur auf den letzten Katalyseschritt vor der Produktfreisetzung hin.
Die zwischen zwei Promotoren vergrabene Oberfläche war 1000 Å2 voneinander entfernt und wurde durch hydrophobe und hydrophile Wechselwirkungen stabilisiert. Die Serinreste (Ser)14 und Threoninreste (Thr)15 in α1 zeigten Wasserstoffbrückenbindungen mit Histidinresten (His)143 bzw. Tyrosinresten (Tyr)142/Lysinresten (Lys)159 des entsprechenden H1-Protomers. Im Gegensatz dazu beteiligten sich die Reste Tyr7, Leucin (Leu)11 und Leu12 an hydrophoben Bindungen mit den Resten Methionin (Met)135, Leu139, Lys159, Isoleucin (Ile)163, Valin (Val)167 und Ile168 aus der H1-Paarung .
Den Leu136-, Leu139- und Met135-Resten in α5 standen symmetrieassoziierte Dimerreste zur Erweiterung der hydrophoben Bindungsschnittstelle gegenüber. Der α1-Rest wurde mithilfe hydrophober Wechselwirkungen und intramolekularer Wasserstoffbrückenbindungen zwischen den α1- und α5-Resten stabilisiert. Das H1-Dimer wurde in der Chromatographieanalyse bestätigt, was darauf hinweist, dass die Dimere funktionelle Zustände darstellten.
Die MPXV H1-Kristallstruktur enthüllte zwei Hotspots für die Entwicklung neuartiger antiviraler Medikamente. Die Dimer-Kontaktstelle ist ein Hotspot, der nur bei PTP/DSP-Molekülen auftritt. Die Hemmung der H1-Dimerisierung könnte möglicherweise die Dimerisierung und Dephosphorylierung des aktivierten STAT1-Phosphor-Tyrosin-Homodimers hemmen. Der zweite Hotspot ist das aktive Zentrum, das, obwohl es sich um die Phosphationenbindungsschleifen mit vergleichbaren Hauptkettenstrukturen befindet, unterschiedliche Seitenketten aufweist und daher die Substratspezifität verändert sein kann, was den Weg für die Entwicklung antiviraler Medikamente ebnet.
Insgesamt zeigten die Studienergebnisse die hochauflösende H1-Kristallstruktur, die eine solide Grundlage für die weitere mechanistische Analyse und Entwicklung neuartiger antiviraler Medikamente gegen neu auftretende virale Krankheitserreger bietet.
Bei diesem Nachrichtenartikel handelte es sich um eine Rezension eines vorläufigen wissenschaftlichen Berichts, der zum Zeitpunkt der Veröffentlichung noch keinem Peer-Review unterzogen worden war. Seit seiner Erstveröffentlichung wurde der wissenschaftliche Bericht nun einem Peer-Review unterzogen und zur Veröffentlichung in einer wissenschaftlichen Zeitschrift angenommen. Links zu den vorläufigen und von Experten überprüften Berichten finden Sie im Abschnitt „Quellen“ am Ende dieses Artikels. Quellen anzeigen
Referenzen:
- Vorläufiger wissenschaftlicher Bericht.
Wen Cui et al. (2022). Kristallstruktur der Affenpocken-H1-Phosphatase, einem antiviralen Wirkstoffziel. bioRxiv. doi: https://doi.org/10.1101/2022.09.30.510410 https://www.biorxiv.org/content/10.1101/2022.09.30.510410v1 - Von Experten begutachteter und veröffentlichter wissenschaftlicher Bericht.
Cui, Wen, Haojun Huang, Yinkai Duan, Zhi Luo, Haofeng Wang, Tenan Zhang, Henry C Nguyen, et al. 2022. „Kristallstruktur der Monkeypox H1-Phosphatase, einem antiviralen Wirkstoffziel.“ Protein & Zelle, November. https://doi.org/10.1093/procel/pwac051. https://academic.oup.com/proteincell/advance-article/doi/10.1093/procel/pwac051/6805938.
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