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Die Studie kommt zu dem Schluss, dass das Affenpockenvirus leicht durch qPCR mit drei klinisch validierten Assays nachgewiesen werden kann


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In einer kürzlich veröffentlichten Studie medRxiv*, Forscher validierten Affenpockenvirus (MPXV) quantitative Polymerase-Kettenreaktion (qPCR)-Assays.

Studie: Evaluierung und klinische Validierung von Affenpockenvirus-Echtzeit-PCR-Assays.  Bildnachweis: Oscar Martinez Troncoso/Shutterstock
Lernen: Bewertung und klinische Validierung von Affenpockenvirus-Echtzeit-PCR-Assays. Bildnachweis: Oscar Martinez Troncoso/Shutterstock

Hintergrund

Fälle von Affenpocken beim Menschen (MPX) wurden seit ihrer Entdeckung in den 1970er Jahren selten außerhalb von MPXV-endemischen Ländern entdeckt. Diese zoonotische Krankheit wurde trotz Warnungen vor einer weltweiten Ausbreitung und der Hinweise auf eine zunehmende Übertragung von Mensch zu Mensch bis zum anhaltenden Ausbruch vernachlässigt. Im Rahmen des anhaltenden MPX-Ausbruchs wurden mehr als 77.000 MPX-Fälle aus über 100 Ländern gemeldet.

MPX-Fälle können mit Fieber, Lymphadenopathie und einem papillären Ausschlag einhergehen. Bei immungeschwächten Personen besteht das Risiko schwerer MPX-Manifestationen bis hin zum Tod. Das antivirale Medikament Tecovirimat (Tpoxx) und der ursprünglich für Pocken entwickelte Impfstoff JYNNEOS sind die einzigen Gegenmaßnahmen gegen MPX. Da eine frühzeitige und schnelle Viruserkennung für die MPX-Prävention und -Behandlung erforderlich ist, ist die Entwicklung von qPCR-Assays von entscheidender Bedeutung, um Übertragungsnetze zu stören.

Die Studie und Ergebnisse

In der vorliegenden Studie bewerteten die Forscher zwei MPXV-spezifische qPCR-Assays, die auf die G2R- und F3L-Loci abzielen, und verglichen ihre Sensitivität, Spezifität und Genauigkeit mit dem Pan-Orthopoxvirus-Assay (OPXV-E9L) der Centers for Disease Control and Prevention (CDC). Die Autoren beschafften im Handel synthetische MPXV-DNA (VR-3270SD) aufgrund des knappen Angebots an klinischen MPXV-Proben und genomischer DNA im Frühjahr 2022.

Die gekaufte Vorlage (VR-3270SD) hatte Bindungsstellen für Primer und Sonden für zahlreiche zuvor entwickelte Assays. Die Forscher schätzten die genaue Kopienzahl dieses Standards durch Tröpfchen-Digital-PCR (ddPCR) auf 1,29 x 108 Kopien/ml für die Loci MPXV-F3L und OPXV-E9L und 1,3 x 108 Kopien/ml für den Locus MPXV-G2R.

Die Autoren testeten 15 Herpes-simplex-Virus (HSV)-positive, 17 Varizella-Zoster-Virus (VZV)-positive und 52 HSV/VZV-negative Hautabstrichproben mit dem OPXV-E9L-Assay und verifizierten, dass sie negativ auf MPXV waren. Der F3L-Assay wies in diesen Proben keine MPXV-DNA nach, während im G2R-Assay eine VZV-positive Probe als positiv für G2R befunden, aber bei Wiederholung als G2R-negativ getestet wurde.

Die G2R- und F3L-Assays zeigten bei 84 Proben eine negative prozentuale Übereinstimmung von 98,8 % bzw. 100 %. Als nächstes testete das Team die Kreuzreaktivität der MPXV-Assays mit Kamelpocken- (CMLV), Kuhpocken- (CPXV) und Vaccinia- (VACV) Viren, die enge phylogenetische Verwandte von MPXV sind. Die MPXV-F3L- und -G2R-Assays detektierten die DNAs von CMLV, CPXV und VACV nicht, während der OPXV-E9L-Assay durchschnittliche Zyklusschwellenwerte (Ct) von 19,8, 25,8 bzw. 23,8 zeigte.

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Die Fähigkeit, MPXV-DNA nachzuweisen, wurde anhand künstlicher positiver Ergebnisse bewertet. Die positive prozentuale Übereinstimmung betrug 100 % für den OPXV-E9L-Assay und 99,1 % für die MPXV-G2R- und -F3L-Assays. Darüber hinaus testeten sie, ob G2R- und F3L-Assays MPXV in (klinischen) Proben genau nachweisen würden, und sicherten sich sieben MPXV-positive Hautabstrichproben von einem Labor für öffentliche Gesundheit (PHL).

Die PHL-Proben wurden vor der Extraktion aufgrund von Volumenbeschränkungen 1:40 verdünnt. Zwanzig klinische MPXV-Proben, die im F3L-Assay positiv getestet wurden, wurden gleichzeitig mit OPXV-E9L- und MPXV-G2R-Assays getestet. Die MPXV-spezifischen Assays hatten für jede Probe im Durchschnitt niedrigere Ct-Werte als der OPXV-E9L-Assay. Darüber hinaus hatte der G2R-Assay in jeder Probe einen niedrigeren Ct-Wert als der F3L-Assay, was mit zwei G2R-Kopien im MPXV-Genom übereinstimmt.

Die Forscher schätzten die Nachweisgrenze (LoD) auf 330 Kopien/ml, was 3,3 Kopien pro (PCR)-Reaktion unter Verwendung von Standardextraktionsmethoden für MPXV-F3L- und -G2R-Assays entspricht. Sie validierten auch den MPXV-F3L-Assay unter Verwendung verschiedener Probentypen, wie z. B. Liquor, Urin, Serum, Plasma, Vollblut und oraler/rektaler/nasopharyngealer/vaginaler Abstriche.

Die negative prozentuale Übereinstimmung betrug 100 % für alle Probentypen. Die positive prozentuale Übereinstimmung betrug 100 % für Nasopharynx-/Rekta-/Vaginalabstriche, Plasma, Liquor, Vollblut und Muttermilch, 95,7 % für Urinproben und 95,5 % für Serumproben. Die LoD für diese Proben wurde auf 1000 Kopien/ml (10 Kopien/ml pro Reaktion) geschätzt.

Unter Verwendung klinischer MPXV-Proben betrug die negative prozentuale Übereinstimmung 100 % für Speichel, Sperma und rektale/orale/trockene Abstriche. Die positive prozentuale Übereinstimmung betrug 100 % für Speichel, Rektalabstriche und Sperma und 95 % für orale/trockene Abstriche. Die LoD für den F3L-Assay betrug 260 Kopien/ml für Sperma, 780 Kopien/ml für Speichel, rektale und orale Abstriche und 810 Kopien/Abstrich für trockene Abstriche.

Schlussfolgerungen

Zusammenfassend bewertete die vorliegende Studie die Sensitivität und Spezifität von MPXV-spezifischen Primer- und Sondensätzen zusammen mit einem Pan-Orthopoxvirus-Assay. Die LoD für diese Assays war so niedrig wie 3,3 Kopien pro (PCR)-Reaktion durch Extraktion aus bis zu 250 μl Probe. Keiner der Assays zeigte eine Kreuzreaktivität mit VZV oder HSV, was auf eine hohe Spezifität hindeutet.

Insgesamt war die Leistung der drei Assays für den MPXV-Nachweis vergleichbar, wobei jeder sehr empfindlich für MPXV-DNA war. Der MPXV-F3L-Assay hatte eine hohe Spezifität für MPXV und zeigte keine Kreuzreaktionen mit HSV oder anderen Orthopoxviren und wird ein entscheidendes Instrument zur Verringerung der MPXV-Übertragung im laufenden Ausbruch sein.

*Wichtiger Hinweis

medRxiv veröffentlicht vorläufige wissenschaftliche Berichte, die nicht von Fachleuten begutachtet wurden und daher nicht als schlüssig angesehen werden sollten, klinische Praxis/gesundheitsbezogenes Verhalten leiten oder als etablierte Informationen behandelt werden sollten.

Referenz:

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Daniel Wom

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