Studie zeigt, dass ACE-2 für die SARS-CoV2-Membranfusion biochemisch nicht erforderlich ist

Eine Studie, die im veröffentlicht wurde bioRxiv* Preprint-Server testeten die Hypothese, dass der Angiotensin-Converting-Enzym-2 (ACE-2)-Rezeptor des schweren akuten respiratorischen Syndroms Coronavirus 2 (SARS-CoV-2) nicht nur ein Bindungsfaktor bei Virusinfektionen ist, sondern auch eine Rolle bei der Aktivierung spielt virales Spike-Protein zur Erleichterung der Membranfusion.

Studie: Der ACE-2-Rezeptor beschleunigt, ist aber für die SARS-CoV-2-Membranfusion biochemisch nicht erforderlich. Bildquelle: Kateryna Kon/Shutterstock

*Wichtiger Hinweis: bioRxiv veröffentlicht vorläufige wissenschaftliche Berichte, die nicht von Experten begutachtet werden und daher nicht als schlüssig angesehen werden sollten, als Leitfaden für die klinische Praxis/gesundheitsbezogenes Verhalten dienen oder als etablierte Informationen behandelt werden sollten.

Hintergrund

Das SARS-CoV-2-Virus infiziert menschliche Zellen mithilfe des ACE-2-Rezeptors des Wirts. Das virale Spike-Protein steuert den Eintritt von SARS-CoV-2 und die Infektion, indem es an die ACE-2-Rezeptoren auf der Oberfläche der menschlichen Zelle bindet. ACE-2 wird durch proteolytische Spaltung aktiviert und treibt die Fusion zwischen der Zellmembran und der Virushülle voran.

Indizien aus Studien deuten darauf hin, dass ACE-2 möglicherweise nicht nur als Bindungsfaktor dient, sondern auch dazu beitragen kann, das SARS-CoV-2-Spike-Protein für die Membranfusion zu aktivieren. Ein besseres Verständnis der Rolle von ACE-2 bei der Membranfusion kann dazu beitragen, den Mechanismus hinter der SARS-CoV-2-Infektion zu veranschaulichen und die zukünftige Entwicklung von SARS-CoV-2 und anderen ähnlichen Viren vorherzusagen.

Die Studie

In der vorliegenden Studie verwendeten die Forscher Desoxyribonukleinsäure (DNA)-Lipid-Bindungen, da diese sich irreversibel in Membranen einfügen können und eine programmierbare Selbstorganisation ermöglichen.

Mit diesem Ansatz können an Lipide konjugierte komplementäre DNA-Stränge in Viruspartikel eingefügt werden, sodass synthetische Liposomen auf die Partikel abzielen können, ohne dass physiologische Rezeptoren erforderlich sind. Die für die Fusion benötigten Auslöser werden dann chemisch rekonstituiert und getestet. Die Fusion wird mit Hilfe der optischen Einzelvirusmikroskopie nachgewiesen, wobei die Veränderungen im Viruszustand während der Fusion mithilfe von Fluoreszenzfarbstoffen überwacht werden. Forscher haben zuvor den DNA-Lipid-Tethering-Ansatz verwendet, um den Viruseintritt verschiedener Virenfamilien, darunter Flaviviren und Orthomyxoviren, zu charakterisieren.

Die Forscher haben mithilfe synthetischer Liposomen die Spike-abhängige Bindung und Fusion an synthetische und zelluläre Membranen gemessen, um die Abwesenheit des ACE-2-Rezeptors sicherzustellen. Drei SARS-CoV-2-Spikes – D614G/N501Y, Wuhan und Omicron (B.1.1.529) – und zwei virale Partikeltypen – virusähnliche Partikel (VLPs), die durch die Expression von S-, M-, E- und N-Proteinen produziert werden Pseudoviren auf einem HIV-Kern – wurden in den Experimenten verwendet.

Das Team inkubierte Zielmembranen und Viruspartikel separat mit komplementären DNA-Strängen, die an DPPE-Lipide konjugiert waren. Sie immobilisierten Zielmembranen in einer mikrofluidischen Flusszelle und ermöglichten so die Bindung der Viruspartikel.

Ergebnisse

Es wurde festgestellt, dass Fusionsereignisse nur dann auftraten, wenn Viruspartikel an Zielmembranen gebunden waren und Protease vorhanden war. Die Fusion wurde hauptsächlich mithilfe der Lipidmischung zwischen der Zielmembran und dem Viruspartikel überwacht und durch Entlöschen des Farbstoffs Texas Red in der Virushülle nachgewiesen, was zu einer Fluoreszenzverstärkung führte. Die DNA-vermittelte Virus-ACE-2-Bindung war spezifisch; Die Anzahl der adsorbierten Partikel verringerte sich um mehr als das 25-fache, wenn DNA weggelassen wurde. Ebenso kam es in Abwesenheit exogener Protease zu keinen Fusionsereignissen.

Beim Vergleich der viralen Fusionskinetik der auf HIV-Kernen pseudotypisierten Omicron- und Wuhan-Spikes und der in dieser Studie verwendeten Wuhan D614G/N501Y-VLPs stellte das Team fest, dass beide Pseudoviren zwar ähnliche Fusionsraten aufwiesen, die VLPs jedoch leicht, aber deutlich schnellere Fusionsraten ergaben.

Der beobachtete Unterschied in den Fusionsraten könnte auf eine Vielzahl von Faktoren zurückzuführen sein, darunter Variationen der Spike-Proteindichte auf den VLPs im Vergleich zum HIV-Kern, E- und M-Proteine ​​in den VLPs, die D614G/N501Y-Mutationen und der aktive Spike-Prozentsatz auf den VLPs VLP-Oberfläche.

Wenn die zur Aktivierung verwendete Protease in den Omicron- und Wuhan-Experimenten variiert wurde, waren die Fusionsraten nicht empfindlich gegenüber der Proteasekonzentration im Bereich von 200 bis 1000 µg/ml. In Übereinstimmung mit früheren Berichten war die Transmembranprotease Serin 2 (TMPRSS2) bei der Aktivierung von Omicron-Spikes für die Membranfusion nicht effizient. Im Fall von D614G/N501Y-Partikeln führte die Zugabe von 40 µg/ml TMPRSS2 jedoch zu einer anderen Fusionskinetik als 200 µg/ml Trypsin.

Diese Beobachtungen legen nahe, dass die proteolytische Spaltung möglicherweise nicht der geschwindigkeitsbestimmende Schritt für die Membranfusion von DNA-gebundenen VLPs ist, da eine Änderung der Proteasekonzentration die Bildung des Enzym-Substrat-Komplexes beeinflussen und Änderungen in der Proteaseidentität die Fusionskinetik verändern sollten.

Bei gleichzeitiger Zugabe von löslichem ACE-2 zur Protease wurde in Experimenten mit Wuhan- und Omicron-Spikes eine signifikante Steigerung der Geschwindigkeit der Lipidmischkinetik beobachtet. Dies zeigt, dass die für die Membranfusion erforderlichen Spike-Protein-Konformationen zwar ohne ACE-2 zugänglich sind, der ACE-2-Rezeptor jedoch Spike-Konformationen fördert, die die Membranfusion begünstigen.

Abschluss

Insgesamt stellten die Forscher fest, dass SARS-CoV-2-Pseudoviren sowie VLPs bei Aktivierung mit einer geeigneten Protease kein ACE-2 für die Membranfusion benötigen. Allerdings beschleunigte die Zugabe von löslichem ACE-2 die Fusionsreaktion beim SARS-CoV-2-Stamm Wuhan und der Omicron-Variante. Die Ergebnisse der kinetischen Analyse ergaben, dass es mindestens zwei geschwindigkeitsbestimmende Schritte für die virale Membranfusion gibt. Einer der Schritte war ACE-2-abhängig, der andere nicht.

Die oben genannten Ergebnisse bestätigen, dass der ACE-2-Rezeptor biochemisch nicht für die SARS-CoV-2-Membranfusion erforderlich ist, wenn ein alternativer Bindungsfaktor vorhanden ist. Da ACE-2 als Faktor mit hoher Affinität für die Virusanheftung an menschliche Zellen fungiert, kann sein Ersatz durch andere Anheftungsfaktoren jedoch die Entwicklungsfähigkeit von SARS-CoV-2 und die virale Fitnessumgebung für künftig auftretende Coronaviren beeinträchtigen .

*Wichtiger Hinweis: bioRxiv veröffentlicht vorläufige wissenschaftliche Berichte, die nicht von Experten begutachtet werden und daher nicht als schlüssig angesehen werden sollten, als Leitfaden für die klinische Praxis/gesundheitsbezogenes Verhalten dienen oder als etablierte Informationen behandelt werden sollten.

Referenz:

• Vorläufiger wissenschaftlicher Bericht.
  Cervantes, M. et al. (2022) „Der ACE-2-Rezeptor beschleunigt, ist aber biochemisch nicht für die SARS-CoV-2-Membranfusion erforderlich.“ bioRxiv. doi: 10.1101/2022.10.22.513347. https://www.biorxiv.org/content/10.1101/2022.10.22.513347v1