Wissenschaftler bestimmen 5.072 essentielle menschliche Gene
In einer kürzlich in der Zeitschrift veröffentlichten Studie Zelleuntersuchten die Forscher die phänotypische Landschaft mehrerer schwer fassbarer essentieller menschlicher Gene, um eine detaillierte Genotyp-Phänotyp-Ressource zu erstellen, die die phänotypischen Folgen der Störung grundlegender zellulärer Prozesse umreißt.
Hintergrund
Die Bestimmung der Rolle essentieller Gene in unterschiedlichen zellulären Prozessen, einschließlich der Visualisierung ihrer Beiträge zur Zellmorphologie, ist entscheidend für das Verständnis der Grundlagen für Zellwachstum, -proliferation und -funktionalität.
Über das Studium
In der vorliegenden Studie führten die Forscher zunächst Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats (CRISPR) – CRISPR-associated protein 9 (Cas9)-basiertes funktionelles Screening durch und identifizierten 5.072 Fitness verleihende essentielle Gene. Als Nächstes wählten sie aus bestehenden sgRNA-Bibliotheken vier Single-Guide-Ribonukleinsäure(sgRNA)-Sequenzen aus, die auf jedes Gen abzielten, sowie 250 „Nicht-Targeting“-sgRNAs.
Sie lieferten die sgRNA-Bibliothek an HeLa-Zellen, die ein integriertes, Doxycyclin-induzierbares Cas9-Konstrukt enthielten. Als nächstes fixierten sie die Zellen und amplifizierten die sgRNA-Sequenzen in situ. Dann färbten und bildeten sie Zellen mit vier Farbstoffen ab, die ihnen dabei halfen, Kernmorphologie, Desoxyribonukleinsäure (DNA)-Schadensreaktion, Mikrotubuli und filamentöses Aktin zu visualisieren.
Nachdem die Zellen entweder als Interphase oder mitotisch klassifiziert wurden, führte das Team nachgelagerte Analysen durch. Dieses bildbasierte Screening lieferte mikroskopische Bilder, die den Forschern dabei halfen, phänotypische Messungen für 1.084 Zellbildparameter zu extrahieren, einschließlich Messungen der Intensität, der subzellulären Verteilung, der Kolokalisation von Flecken sowie der Größe und Form von Zellen und Kernen. Die Forscher verglichen sgRNA-Identitäten für über 31 Millionen Zellen mit einem Median von 6.119 Zellen pro Genziel für vier sgRNAs. Schließlich führten die Forscher Live-Cell-Pooled-Imaging durch, um Gene zu identifizieren, die für die Chromosomentrennung erforderlich sind.
Studienergebnisse
Die gepoolte mikroskopische Analyse von >31 Millionen einzelnen Knockout-Zellen für Tausende von Fitness verleihenden menschlichen Genen identifizierte spezifische Beiträge zu biologischen Kernprozessen basierend auf den resultierenden zellulären Phänotypen. Zellparameter sind über eine große Zellpopulation hinweg direkt vergleichbar und werden als phänotypische „Fingerabdrücke“ eines Genziels bezeichnet. Durch den Vergleich dieser Phänotypprofile definierten die Forscher kofunktionale Genbeziehungen mit ausreichender Auflösung, um verwandte Rollen in spezifischen zellulären Prozessen zu unterscheiden. Allerdings reichten nur vier zelluläre Farbstoffe aus, um funktionelle Beziehungen zwischen Genen über verschiedene biologische Wege hinweg zu identifizieren, ohne spezifische zelluläre Marker zu analysieren, die jedem zellulären Weg mit einer unterschiedlichen Funktion entsprechen.
Neben der Identifizierung etablierter Beziehungen lieferte die aktuelle Arbeit mehrere Vorhersagen für die Beiträge unvollständig charakterisierter Gene zu grundlegenden zellulären Prozessen. Beispielsweise implizierte die Phänotyp-Clustering-Analyse C7orf26 als eine Untereinheit des Core-Integrator-Komplexes, C1orf131 als Regulator der Ribosomen-Biogenese und AKIRIN2 in der Proteasom-Funktion. Sie identifizierten auch Gen-Knockouts, die zu Defekten in der mitotischen Funktion führen, einschließlich unerwarteter Rollen der membrangebundenen Transporter AQP7 und ATP1A1 und der zellulären Osmolarität bei der Förderung einer genauen Chromosomentrennung.
Darüber hinaus enthüllte dieses Papier die Rolle mehrerer Genexpressionsregulatoren bei der Kontrolle der Zellteilung, einschließlich des vorhergesagten Transkriptionsfaktors ZNF335, des DREAM-Komplexes (LIN52), des 30-Enden-mRNA-Verarbeitungskomplexes (CLP1) und des kleineren Spliceosoms (RNPC3). die Expression spezifischer Zellteilungskomponenten. Diese Beispiele unterstreichen die Leistungsfähigkeit des optischen Screenings zur Identifizierung kofunktionaler Gene über verschiedene biologische Wege hinweg, mit dem Potenzial für weitere Entdeckungen aus den hier veröffentlichten Daten.
Schlussfolgerungen
Die Forscher nutzten komplexe, mehrdimensionale, bildbasierte Phänotypen effizient, um funktional relevante Gencluster über verschiedene zelluläre Prozesse hinweg in einem Maßstab zu erhalten, der viel größer ist als jeder einzelne bildbasierte gepoolte Profiling-Screen. Infolgedessen verfügen Forscher jetzt über eine leistungsstarke Datenquelle, die sie erkunden können, und über eine umfassende Testumgebung, um Analysetechniken zu entwickeln.
Zwei Proteine könnten in einem einzigen biologischen Weg wirken, ohne eine direkte Wechselwirkung zu zeigen. Neben der genauen Identifizierung von kofunktionalen Genen über eine Vielzahl von zellulären Prozessen hinweg lieferte die aktuelle Studie einen hochskalierbaren orthogonalen Ansatz für proteomweite Proteininteraktionsstudien. Darüber hinaus definierte die quantitative bildbasierte phänotypische Profilerstellung bemerkenswert Gencluster für pan-essentielle Gene, wie z. B. Ribosomenkomponenten, die keine unterschiedlichen Anforderungen über Zelllinien hinweg aufweisen. In vielen Fällen identifizierte diese Analyse auch zusätzliche Gene und eine feinkörnigere Auflösung für ihre Gencluster, was eine Unterscheidung zwischen Core-Ribosomen-Untereinheiten und Ribosomen-Biogenesefaktoren ermöglichte.
Der Studienansatz war auch sehr erfolgreich bei der Identifizierung von Genclustern für morphologische Prozesse, einschließlich Zytokinese, Kerntransport, Chromosomenkondensation und andere, die aufgrund von Transkriptionsveränderungen ansonsten schwer zu identifizieren wären. Es erzeugte auch komplexe Profildaten, und die Störungsidentität für jede Zelle ermöglichte die direkte Korrelation mehrerer hochdimensionaler Phänotypen mit einzelnen Störungen in einem einzigen Experiment. Insgesamt haben sich relativ kostengünstige, bildbasierte gepoolte CRISPR-Profiling-Screens als robuste Strategie zur Definition von Gennetzwerken und der funktionellen Rolle menschlicher Gene herausgestellt. Darüber hinaus waren gepoolte bildbasierte Bildschirme im Vergleich zu angeordneten bildbasierten Bildschirmen vergleichsweise einfach zu skalieren, wobei gemischte Kontrollen eine robuste statistische Basis für Vergleiche lieferten.
Referenz:
- Die phänotypische Landschaft wesentlicher menschlicher Gene, Luke Funk, Kuan-Chung Su, Jimmy Ly, David Feldman, Avtar Singh, Brittania Moodie, Paul C.Blainey, Iain M.Cheeseman, Cell 2022, DOI: https://doi.org/10.1016/j.cell.2022.10.017, https://www.sciencedirect.com/science/article/abs/pii/S0092867422013599
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