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Fehlpaarungen in den Primer- und Sondensequenzen aktueller Monkeypox-Virus-Diagnosetests müssen korrigiert werden, um die Nachweisgenauigkeit zu verbessern

In einer aktuellen Studie, die im veröffentlicht wurde medRxiv* Preprint-Server, Forscher analysierten die Primer- und Sondensequenzen der vom Centers for Disease Control and Prevention (CDC) der Vereinigten Staaten empfohlenen generischen Echtzeit-Polymerasekettenreaktionstests (PCR) für das Affenpockenvirus (MPXV).

Studie: Große Fehlpaarungen in den Sequenzen von Primern und Sonden für Diagnosetests für das Monkeypox-Virus.  Bildnachweis: Dotted Yeti/Shutterstock
Studie: Große Fehlpaarungen in den Sequenzen von Primern und Sonden für Diagnosetests für das Monkeypox-Virus. Bildnachweis: Dotted Yeti/Shutterstock

Bei diesem Nachrichtenartikel handelte es sich um eine Rezension eines vorläufigen wissenschaftlichen Berichts, der zum Zeitpunkt der Veröffentlichung noch keinem Peer-Review unterzogen worden war. Seit seiner Erstveröffentlichung wurde der wissenschaftliche Bericht nun einem Peer-Review unterzogen und zur Veröffentlichung in einer wissenschaftlichen Zeitschrift angenommen. Links zu den vorläufigen und von Experten überprüften Berichten finden Sie im Abschnitt „Quellen“ am Ende dieses Artikels. Quellen anzeigen

Hintergrund

MPXV, eine Art der Gattung Orthopoxvirus, besitzt ein doppelsträngiges Desoxyribonukleinsäure (DNA)-Genom. Die Weltgesundheitsorganisation (WHO) erklärte am 23. Juli 2022 das Wiederauftreten von MPXV zum Gesundheitsnotstand, nachdem über 66.000 Fälle in 106 Ländern gemeldet wurden. MPXV ist das zweite Virus dieser Art, das sich weltweit schnell verbreitet, nachdem das schwere akute respiratorische Syndrom Coronavirus 2 (SARS-CoV-2) allmählich zu einem endemischen Virus geworden ist.

Was SARS-CoV-2 betrifft, veröffentlichte das CDC einen Echtzeit-PCR-Test zum MPXV-Nachweis in Abwasserproben, bei dem generische Primer und Sonden eingesetzt wurden, die auf einen westafrikanischen und einen MPXV-Stamm aus dem Kongobecken abzielten. Ebenso weisen andere Echtzeit-PCR-Assays MPXV in klinischen Proben nach.

Das Problem besteht darin, dass die in diesen generischen PCR-Assays verwendeten Primer und Sonden auf MPXV-Stämmen basieren, die vor fast einem Jahrzehnt zwischen 2002 und 2009 zirkulierten. Angesichts der schnellen Entwicklung aller DNA-Viren sind die Regionen, auf die diese Oligos abzielen, die für den MPXV-Nachweis verwendet werden muss erhebliche Mutationen erfahren haben.

Über die Studie

In der vorliegenden Studie haben die Forscher 683 vollständige MPXV-Genome aus der GISAID-Datenbank (Global Initiative on Avian Influenza Data) abgerufen, die bis zum 5. August 2022 verfügbar ist, und ihre Oligosequenzen mit den Primersequenzen der derzeit verwendeten MPXV-Diagnosetests abgeglichen. Darüber hinaus haben sie Primer- und Sondensequenzen und ihre umgekehrten Komplemente in den sieben Echtzeit-PCR-Assays mit 1.779 MPXV-Genomen abgeglichen und den Prozentsatz der Genome mit einer 100-prozentigen Übereinstimmung berechnet. Diese Tests zielten auf die Gene O2L, F3L, C3L und G2R für den MPXV-Nachweis ab.

Das Team evaluierte außerdem drei Echtzeit-PCR-Assays zum Nachweis von Viren der Gattung Orthopoxvirus. Schließlich synthetisierten die Forscher die Mismatch-korrigierten Primer oder ein synthetisches MPXV-Genfragment, um die Mismatch-Effekte zu testen, und verglichen sie mit dem generischen Assay zum MPXV-Nachweis.

Studienergebnisse

Sie verwendeten 1.730 vollständige MPXV-Genome, die während des weltweiten Ausbruchs 2022 entnommen wurden. Die Ausrichtung der drei Oligosequenzen und ihrer umgekehrten Komplemente aus den generischen MPXV-Assays ergab generische MPXV-Vorwärtssequenzen (MPXV-F) mit 100 % Identität zu vier Genomen und generischen Rückwärtsprimern (MPXV-R), die zu 1,73 % der Genomen passten. Darüber hinaus fanden die Forscher 31 Sequenzfehlpaarungen in 99,08 % bzw. 97,46 % der generischen MPXV-Vorwärtssequenzen (MPXV-F) bzw. 32 generischen Rückwärtsprimer (MPXV-R).

Während Ersteres in 99,08 % der veröffentlichten MPXV-Genomen eine einzige synonyme Mutation A194165G aufwies, hatte Letzteres in 97,46 % der Genomen eine nicht-synonyme Substitution, G194233A. Im Gegenteil, die MPXV-Sondensequenz (MPV-P) war konserviert und stimmte mit 99,31 % der Genome in der Datenbank überein.

Das primäre Ergebnis der Studie war, dass die derzeit verwendeten generischen MPXV-Tests MPXV möglicherweise nicht optimal und genau nachweisen. Unabhängig von der Position könnte jede Fehlpaarung innerhalb der Primersequenz die thermische Stabilität des Primer-Matrizen-DNA-Duplex verringern und die PCR-Leistung beeinträchtigen. Die Autoren stellten eine Nichtübereinstimmung zweier Primer-Template fest, die kombinierte Auswirkungen auf die PCR-Leistung hatte. Es ergab eine etwa 11-fach schlechtere Schätzung der anfänglichen Matrizen-DNA und eine vierfache Erhöhung der Nachweisgrenze (LOD) von 95 %. Daher könnte der Mismatch-korrigierte Assay mit absoluter Komplementarität zwischen Primern und aktuellen MPXV-Genomen einen empfindlicheren und genaueren MPXV-Nachweis ermöglichen.

Darüber hinaus zeigten die Studienergebnisse, dass genetische Variationen in den Primer-Sonden-Regionen des MPXV-Genoms auf ein zeitliches und räumliches Entstehungsmuster der Affenpockenerkrankung hinweisen könnten. Drei Assays, MPV_F3L, MPV_G2R_WA, 283 und OPV_F8L, zeigten im Jahr 2022 den höchsten Übereinstimmungswert von über >99 % mit der globalen MPXV-Genomdatenbank. Allerdings variiert die Wahl des Assays auch je nach Probentyp. Beispielsweise funktionierten diese drei Tests gut für klinische Proben, nicht jedoch für Abwasserproben, die menschliche Ausscheidungen sowie Ausscheidungen von Katzen, Hunden, Mäusen, Kaninchen und Kühen enthalten könnten.

Abschluss

Der in der Studie entwickelte Mismatch-korrigierte Assay wies eine Komplementarität von über 97 % zu MPXV-Genomen auf. Somit zeigte es eine höhere Empfindlichkeit und ein verbessertes Quantifizierungspotenzial und könnte den MPXV-Nachweis unterstützen.

Verbesserte MPXV-Diagnosefunktionen sind von entscheidender Bedeutung, wenn Beamte und Ärzte des öffentlichen Gesundheitswesens den MPXV-Ausbruch bekämpfen. Zukünftige Studien sollten sich daher auf die Entwicklung eines noch besseren diagnostischen MPXV-Assays konzentrieren, der andere Faktoren berücksichtigt, die die diagnostische Effizienz und durch Fehlpaarungen verursachte Effekte beeinflussen (z. B. die Qualität der Template-DNA, des PCR-Master-Mix und der Primer-Dimer-Bildung).

Bei diesem Nachrichtenartikel handelte es sich um eine Rezension eines vorläufigen wissenschaftlichen Berichts, der zum Zeitpunkt der Veröffentlichung noch keinem Peer-Review unterzogen worden war. Seit seiner Erstveröffentlichung wurde der wissenschaftliche Bericht nun einem Peer-Review unterzogen und zur Veröffentlichung in einer wissenschaftlichen Zeitschrift angenommen. Links zu den vorläufigen und von Experten überprüften Berichten finden Sie im Abschnitt „Quellen“ am Ende dieses Artikels. Quellen anzeigen

Referenzen:

Artikelrevisionen

  • 15. Mai 2023 – Das vorab gedruckte vorläufige Forschungspapier, auf dem dieser Artikel basiert, wurde zur Veröffentlichung in einer von Experten begutachteten wissenschaftlichen Zeitschrift angenommen. Dieser Artikel wurde entsprechend bearbeitet und enthält nun einen Link zum endgültigen, von Experten begutachteten Artikel, der jetzt im Abschnitt „Quellen“ angezeigt wird.

Daniel Wom

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