Wissenschaftler entwickeln Organoide menschlicher Speicheldrüsen, um die Infektiosität von SARS-CoV-2 zu testen

In einer kürzlich in der Zeitschrift veröffentlichten Studie NaturzellbiologieForscher zeigten in vitro mithilfe eines organoiden Kulturmodells die Anfälligkeit der Speicheldrüsen für eine schwere Infektion mit dem akuten respiratorischen Syndrom Coronavirus-2 (SARS-CoV-2).

Studie: Vom Menschen induzierte pluripotente, aus Stammzellen gewonnene Speicheldrüsenorganoide modellieren die SARS-CoV-2-Infektion und -Replikation. Bildnachweis: NIAID

Hintergrund

Obwohl das Atmungssystem, einschließlich der oberen Atemwege (URT) und der Lunge, die Hauptzielorte von SARS-CoV-2 sind, gibt es zunehmend Hinweise darauf, dass es mehrere Organe befällt. Beispielsweise exprimieren Mundschleimhäute und Speicheldrüsen in großem Umfang zwei SARS-CoV-2-Eintrittsfaktoren, das Angiotensin-Converting-Enzym 2 (ACE2) und die Transmembran-Serinprotease 2 (TMPRSS2). Außerdem dienen sie als Reservoir für SARS-CoV-2.

Interessanterweise verlaufen 80 % der SARS-CoV-2-Infektionen asymptomatisch. Darüber hinaus wurde in Studien berichtet, dass SARS-CoV-2 auf die Speicheldrüsen des Menschen abzielt und infektiöse Virionen aus dem Speichel asymptomatischer Personen zur weiteren Virusübertragung beitragen.

Aufgrund der Fähigkeit von SARS-CoV-2, mehrere Arten von Organoiden zu infizieren, könnte sich ein Organoid-Kulturmodell als geeignet erweisen, die Infektion durch SARS-CoV-2 in Speicheldrüsen (in vitro) nachzuweisen. Aufgrund des Mangels an geeigneten In-vitro-Modellen konnten Studien jedoch nicht die Mechanismen aufklären, die der Infektion und Replikation von SARS-CoV-2 in den Speicheldrüsen und der anschließenden Sekretion in den Speichel zugrunde liegen.

Über die Studie

In der vorliegenden Studie erzeugten die Forscher funktionelle Speicheldrüsenorganoide aus menschlichen induzierten pluripotenten Stammzellen (hiPSCs) mit ähnlichen morphologischen Merkmalen und physiologischen Funktionen (in vivo) wie menschliche Speicheldrüsen. Darüber hinaus verfügten diese Organoide über Speicheldrüsen-spezifische Zelllinien.

Das Team führte am 80. Tag mithilfe der 10X Genomics-Plattform eine Einzelzell-Ribonukleinsäuresequenzierung (scRNA-seq) von hiSG-Zellen durch. Darüber hinaus isolierten sie die Organoide am 60. Tag und kultivierten sie mit dem Fibroblasten-Wachstumsfaktor (FGF) 7 und 10 bis zum 80. Tag, um die beobachteten Verzweigungsstrukturen zu charakterisieren.

Das SRY-Box-Transkriptionsfaktor-9-Gen (SOX9) reguliert die Entwicklung der Speicheldrüsen von Mäusen und Menschen. In seiner Abwesenheit können die Speicheldrüsen keine verzweigte Morphogenese durchlaufen. Daher unterdrückten die Forscher SOX9 während der hiSG-Induktion, um herauszufinden, ob hiSGs den SOX9-vermittelten Entwicklungsprozess rekapitulierten.

Studienergebnisse

Die vom Menschen induzierten Speicheldrüsen (hiSGs) hatten ähnliche Eigenschaften wie embryonale Speicheldrüsen, einschließlich morphologischer Eigenschaften, Proteinmarker-Expression und Genexpressionsmerkmalen. In Übereinstimmung mit an Mäusen durchgeführten In-vivo-Studien hemmte der SOX9-Knockdown die Verzweigungsbildung in hiPSCs, was darauf hindeutet, dass dieses Gen für die Entwicklung der menschlichen Speicheldrüsen von entscheidender Bedeutung ist. Somit könnte dieses Studienmodell Tiermodelle ersetzen, die zur Untersuchung der menschlichen Speicheldrüsenentwicklung verwendet werden.

Die hiSGs ahmten morphologisch und funktionell natürliche Speicheldrüsen nach. Unvoreingenommenes scRNA-seq-Clustering identifizierte sechs Hauptzellgruppen, die weiter in zelluläre Subtypen unterteilbar sind. Die kleine mesenchymale Population in den HiSGs zeigte keine Merkmale des Speicheldrüsenmesenchyms. Im Gegensatz dazu bestand die Epithelzellgruppe aus fünf Zellgruppen: Azinus-, Basal-, Duktal-, Myoepithel- und aktiv zyklische Zellen. Die hiSGs umfassten unabhängige Abstammungslinien von Basal-Myoepithelzellen aus der Duktal-Azinus-Abstammungslinie, und eine Pseudozeitanalyse zeigte die Unterschiede zwischen diesen beiden Zellabstammungslinien.

Die grundlegende Funktion der Speicheldrüsen besteht darin, durch Acetylcholin induzierte Flüssigkeit über muskarinische Acetylcholinrezeptorwege abzusondern. Bei den hiSGs führte die Behandlung mit Carbachol, einem muskarinischen Acetylcholinrezeptor-Agonisten, vorübergehend und dosisabhängig zu einem Anstieg der intrazellulären Calciumspiegel. Darüber hinaus zeigten orthotopisch transplantierte hiSGs den Phänotyp reifer Speicheldrüsen, die im Laufe der Zeit an einer Empfängerstelle bei Mäusen transplantiert wurden.

Die scRNA-seq- und Immunfluoreszenzanalysen zeigten auch, dass die Duktuszellen innerhalb der hiSGs reichlich ACE2 und TMPRSS2 exprimierten, ähnlich wie normale Speicheldrüsen. Die Immunfärbungsmethode ergab, dass Duktalzellen auf der apikalen Seite von hiSGs zwar stark ACE2 exprimierten, Duktalzellen und Azinuszellen jedoch TMPRSS2 exprimierten. Bei Kontakt mit SARS-CoV-2 infizierten sich hiSGs und zeigten innerhalb von 24 Stunden nach der Infektion eine SARS-CoV-2-Replikation. Die Autoren entdeckten das SARS-CoV-2-Nukleoprotein auch in infizierten Duktalzellen. Dementsprechend zeigte der Assay der mittleren infektiösen Gewebekultur (TCID50) infektiöse Viren in hiSGs, die nach 24 Stunden ihren Höhepunkt erreichten, später jedoch abnahmen.

Schlussfolgerungen

Tatsächlich könnten die in der aktuellen Studie entwickelten hiSGs als wertvolles Modell für die Reproduktion heterogener Zellpopulationen in menschlichen Speicheldrüsen dienen. Darüber hinaus könnten hiSGs die Funktionsanalyse von Genen während der Entwicklung unterstützen und als vielversprechendes Instrument zur Untersuchung von SARS-CoV-2-Infektionen in Speicheldrüsen auf molekularer Ebene dienen. Darüber hinaus zeigten die Forscher, dass hiSGs im Vergleich zu Organoiden, die aus Gewebestamm-Vorläuferzellen aus erwachsenen menschlichen Speicheldrüsen stammen, mehrere Vorteile hatten. Beispielsweise konnten sie mit dem Gen-Editing-Tool CRISPR (Clustered Regular Interspaced Short Palindromic Repeats) und CRISPR-assoziiertes Protein 9 (Cas9) leicht genetisch verändert werden und waren relativ einfach zu kultivieren.

Referenz:

• Tanaka, J., Senpuku, H., Ogawa, M. et al. Vom Menschen induzierte pluripotente, aus Stammzellen gewonnene Speicheldrüsenorganoide modellieren die SARS-CoV-2-Infektion und -Replikation. Nat Cell Biol (2022). https://doi.org/10.1038/s41556-022-01007-6, https://www.nature.com/articles/s41556-022-01007-6#Sec7