Vor-Ort-Test auf hochempfindliche Affenpockenviren mit CRISPR/Cas12a

Das Affenpockenvirus (MPXV), das erstmals 1958 isoliert wurde, ist ein doppelsträngiges DNA-Virus (dsDNA). Als im Jahr 1970 in der Demokratischen Republik Kongo der erste Fall beim Menschen festgestellt wurde, wurde die Krankheit als zoonotische Krankheit erkannt. Aufgrund der weit verbreiteten Übertragung aus Zentral- und Westafrika besteht derzeit weltweit Besorgnis über MPXV.

Um die Ausbreitung dieses Virus einzudämmen, ist ein schneller, hochempfindlicher und spezifischer Nachweis unerlässlich. In einer neuen Studie, die im veröffentlicht wurde medRxiv* Preprint-Server: Forscher in China haben erstmals einen MPXV-Assay entwickelt, der geclusterte, regelmäßig beabstandete kurze palindromische Wiederholungen und CRISPR-assoziiertes Protein (CRISPR/Cas) sowie rekombinasegestützte Amplifikation (RAA) kombiniert. Der Assay zeigte eine hohe Selektivität und konnte zwischen MPXV und anderen Orthopoxviren unterscheiden.

Studie: CRISPR/Cas12a-vermittelte hochempfindliche Tests auf Affenpockenviren vor Ort. Bildquelle: Dotted Yeti / Shutterstock

Bei diesem Nachrichtenartikel handelte es sich um eine Rezension eines vorläufigen wissenschaftlichen Berichts, der zum Zeitpunkt der Veröffentlichung noch keinem Peer-Review unterzogen worden war. Seit seiner Erstveröffentlichung wurde der wissenschaftliche Bericht nun einem Peer-Review unterzogen und zur Veröffentlichung in einer wissenschaftlichen Zeitschrift angenommen. Links zu den vorläufigen und von Experten überprüften Berichten finden Sie im Abschnitt „Quellen“ am Ende dieses Artikels. Quellen anzeigen

Hintergrund

Derzeit werden bei MPXV-Tests Methoden wie der Enzymimmunoassay (ELISA), die Polymerasekettenreaktion (PCR) und die schleifenvermittelte isotherme Amplifikation (LAMP) verwendet. PCR ist der Goldstandard und genau und empfindlich, aber in Gebieten mit geringen Ressourcen schwierig einzusetzen. ELISA könnte bei kürzlich erfolgter oder entfernter Impfung falsch positive Ergebnisse liefern, und die Nachteile von LAMP hängen mit einem komplizierten Primerdesign, einer schlechten quantitativen Leistung usw. zusammen. Schnelle, ultraempfindliche und kostengünstige Methoden, die den MPXV-Nachweis vor Ort und einfach erleichtern, fehlen bisher.

Über die Studie

CRISPR/Cas wurde erstmals im adaptiven Immunsystem von Prokaryoten entdeckt. Das CRISPR/Cas12a-System integriert die Signaltransduktion und die Bioerkennung wurde zum Nachweis mehrerer Viren eingesetzt, darunter das schwere akute respiratorische Syndrom Coronavirus 2 (SARS-CoV-2). Es bietet viele Vorteile im Zusammenhang mit milden Bedingungen, hoher Empfindlichkeit, einfacher Bedienung und leistungsstarker Signalverstärkung.

Bisher wurden keine kritischen Probleme im Zusammenhang mit der Verwendung der CRISPR-Technologie bei der MPXV-Erkennung gemeldet, wie z. B. Sondenscreening, Analyseleistung, Voramplifikation und Point-of-Care-Tests (POCT). Daher wurde in der aktuellen Studie erstmals ein schneller und hochempfindlicher Assay vorgeschlagen, der Rekombinase-unterstützte Amplifikation (RAA) und CRISPR/Cas12a, also den RAA-Cas12a-MPXV-Assay, kombiniert. Das Prinzip umfasste drei Schritte: RAA-Amplifikation, CRISPR/Cas12a-Spaltung und Signalausgabe.

Wichtigste Ergebnisse

Im ersten Schritt erzeugte die RAA-Auswahl der DNA-Matrize eine große Anzahl von Amplifikaten. Dadurch wurde die Empfindlichkeit des Assays deutlich erhöht. Im zweiten Schritt wurde die Trans-Spaltungsaktivität von Cas12a aktiviert, was zur Spaltung zahlreicher ssDNA-Reporter führte. Der letzte Schritt führte zu zwei verschiedenen Signalausgabemodi: Fluoreszenzassay für FQ-Reporter und Lateral-Flow-Strip, was die Benutzerfreundlichkeit und Eignung des RAA-Cas12a-MPXV-Assays verbesserte.

Fluoreszenzergebnisse mit oder ohne DNA-Vorlagen und dem RAA-Produkt wurden verglichen, um die Durchführbarkeit des Tests zu bewerten. Die Gruppe ohne DNA war die Kontrolle, die keine signifikante Fluoreszenzänderung zeigte. Dies deutete darauf hin, dass in Abwesenheit von DNA-Matrizen kein RAA-Amplifikat generiert wurde, das von nachfolgendem CRISPR/Cas12a erkannt werden konnte.

Um eine höhere Selektivität und Empfindlichkeit zu gewährleisten, wurden drei Primerpaare entworfen, die an verschiedene Stellen des MPXV-spezifischen F3L-Gens banden. Um die optimalen Primer für zukünftige Experimente zu finden, wurden der RAA-Cas12a-MPXV-Fluoreszenztest und die Agarosegelelektrophorese (AGE) durchgeführt. Das dritte Paar (F2+R2) erreichte das hellste spezifische Verstärkungsband.

Viele wichtige experimentelle Bedingungen im Zusammenhang mit dem CRISPR/Cas12a-System und dem RAA-Cas12a-MPXV-Assay wurden optimiert, wobei die Temperatur und die Reaktionszeit von RAA an erster Stelle standen. Als nächstes wurde das CRISPR/Cas12a-System mit crRNA2 optimiert.

Der RAA-Cas12a-MPXV-Fluoreszenztest wurde als einfach zu bedienen und für Schnelltests geeignet erachtet. Im Vergleich zum PCR-Cas12a-MPXV-Fluoreszenztest zeigte der RAA-Cas12a-MPXV-Fluoreszenztest eine hervorragende Empfindlichkeit mit einer 1000-fach niedrigeren Nachweisgrenze (LOD).

Die Selektivität des RAA-Cas12a-MPXV-Fluoreszenztests wurde durch Vergleich des von MPXV erzeugten Fluoreszenzgrades mit anderen Viren wie dem Variolavirus (VARV), dem Kuhpockenvirus (CPXV) und dem schweren akuten respiratorischen Syndrom Coronavirus-2 (SARS-) bestimmt. CoV-2), Toxoplasma Gondii-Virus (TOXV) und Afrikanisches Schweinepest-Virus (ASFV). Sowohl die Beobachtung mit bloßem Auge als auch die Fluoreszenzwerte zeigten, dass nur MPXV eine verstärkte Fluoreszenz induzierte, während dies bei anderen Viren nicht der Fall war.

Der FAM-Biotin-Reporter (FB-Reporter) wurde als Ersatz für den FQ-Reporter des Fluoreszenzassays entwickelt und anschließend wurde der RAA-Cas12a-MPXV-Lateral-Flow-Strip-Assay für POCT etabliert. Die Zugabe einer Reaktionslösung, die intakte FB-Reporter enthielt, spaltete FAMs und Biotin in den Probenpads auf und verursachte eine schnelle Bindung der Anti-FAM-Antikörper/AuNP-Komplexe mit isolierten FAMs und FB-Reportern, während die Probe vorwärts wanderte. Schließlich fing Streptavidin, immobilisiert an der Kontrollbande, gespaltene Biotine und die FB-Reporter/Anti-FAM-Antikörper/AuNP-Komplexe ein.

Zunächst erschien die Kontrollbande aufgrund der Aggregation von AuNPs rot. Anschließend wanderte der Rest der isolierten FAM/Anti-FAM-Antikörper/AuNP-Komplexe zur Testbande und reagierte mit rot erscheinenden FAM-Antikörpern. Schließlich aktivierten Amplikons Cas12a, um alle FB-Reporter zu spalten. Der Farbwechsel blieb nur beim Testband bestehen.

Kurz gesagt: Wenn die Farbveränderung nur in der Testbande oder sowohl in der Kontrolle als auch in der Testbande beobachtet wurde, wurde dies als positives Ergebnis gewertet. Wenn die Farbänderung dagegen nur an der Kontrollbande festgestellt wurde, deutete dies auf ein negatives Ergebnis hin, d. h. das Fehlen von DNA-Matrizen führte dazu, dass keine Amplifikate für die Cas12a-Aktivierung vorhanden waren.

Schlussfolgerungen

Ein entscheidender Vorteil des RAA-Cas12a-MPXV-Assays besteht darin, dass er im Vergleich zu herkömmlichen Verfahren bei einer milden Temperatur durchgeführt werden kann. Wichtig ist, dass dieser Assay eine leistungsstarke MPXV-Diagnosemethode mit überlegener Selektivität, Empfindlichkeit und Portabilität war.

Bei diesem Nachrichtenartikel handelte es sich um eine Rezension eines vorläufigen wissenschaftlichen Berichts, der zum Zeitpunkt der Veröffentlichung noch keinem Peer-Review unterzogen worden war. Seit seiner Erstveröffentlichung wurde der wissenschaftliche Bericht nun einem Peer-Review unterzogen und zur Veröffentlichung in einer wissenschaftlichen Zeitschrift angenommen. Links zu den vorläufigen und von Experten überprüften Berichten finden Sie im Abschnitt „Quellen“ am Ende dieses Artikels. Quellen anzeigen

Referenzen:

• Vorläufiger wissenschaftlicher Bericht.
  Zhao, F. et al. (2022) CRISPR/Cas12a-vermittelte ultrasensitive und Vor-Ort-Affenpocken-Virustests, medRxiv 2022.10.10.22280931; doi: https://doi.org/10.1101/2022.10.10.22280931, https://www.medrxiv.org/content/10.1101/2022.10.10.22280931v1
• Von Experten begutachteter und veröffentlichter wissenschaftlicher Bericht.
  Zhao, Furong, Pei Wang, Haoxuan Wang, Sirui Liu, Muhammad Sohail, Xing Zhang, Bingzhi Li und He Huang. 2023. „CRISPR/Cas12a-vermittelte hochempfindliche und Vor-Ort-Affenpocken-Virustests.“ Analytische Methoden 15 (17): 2105–13. https://doi.org/10.1039/D2AY01998A. https://pubs.rsc.org/en/content/articlelanding/2023/AY/D2AY01998A.

Artikelrevisionen

• 16. Mai 2023 – Das vorab gedruckte vorläufige Forschungspapier, auf dem dieser Artikel basiert, wurde zur Veröffentlichung in einer von Experten begutachteten wissenschaftlichen Zeitschrift angenommen. Dieser Artikel wurde entsprechend bearbeitet und enthält nun einen Link zum endgültigen, von Experten begutachteten Artikel, der jetzt im Abschnitt „Quellen“ angezeigt wird.